聚合酶鏈反應的常見問題分析與解決方法：擴增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶)：引物用量偏大,，引物的特異性不高,。應調(diào)換引物或降低引物的使用量。循環(huán)的次數(shù)過多,。適當增加模板的量,，減少循環(huán)次數(shù),。酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好,，應降低酶量或調(diào)換另一來源的酶。退火溫度偏低,，退火及延伸時間偏長,。應提高退火溫度，減少變性與延伸時間,，也可采用二種溫度的PCR擴增,。以2度為梯度設計梯度PCR反應優(yōu)化退火溫度。 樣品處理不當,。Mg2+濃度偏高,，因適當調(diào)整Mg2+使用濃度。若為PCR試劑盒,，也可能時試劑盒本身質(zhì)量有問題,。復制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發(fā)生,。冰上準備反應體系或采用熱啟動聚合酶,。聚合酶鏈式反應的模板的取材主要依據(jù)PCR的擴增對象，可以是病原體標本如病毒,、細菌,、菌類等。溫州細胞數(shù)字PCR供應商

聚合酶鏈式反應的常見問題：靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染,，導致假陽性,。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣內(nèi)或濺出離心管外,。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進頭等均應一次性使用,。必要時,，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射,，以破壞存在的核酸,。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短,，但有一定的同源性,。可互相拼接,，與引物互補后,，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導致假陽性的產(chǎn)生,，可用巢式PCR方法來減輕或消除,。骨頭數(shù)字PCRPCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,，能將皮克量級的起始待測模板擴增到微克水平。

聚合酶鏈式反應是一種體外迅速擴增DN段的技術,，它能以極少量的DNA為模版,，在幾小時內(nèi)復制出上百萬份的DNA拷貝。DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑,。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝,。在實驗中發(fā)現(xiàn),，DNA在高溫時由于兩條鏈之間的氫鍵被破壞也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復形成為雙鏈,。因此,，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，并設計引物做啟動子,，加入DNA聚合酶,、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。但是,，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此,，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,，不但操作煩瑣，而且價格昂貴,，制約了PCR技術的應用和發(fā)展,。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,，不需要每個循環(huán)加酶,，使PCR技術變得非常簡捷、同時也降低了成本,，PCR技術得以大量應用,，并逐步應用于臨床。

聚合酶鏈式反應的試驗污染：PCR擴增產(chǎn)物污染：這是PCR反應中很主要很常見的污染問題,。因為PCR產(chǎn)物拷貝量大（一般為1013拷貝/ml）,，遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染,，就可形成假陽性,。還有一種容易忽視，很可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染,。在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠,，在操作時比較劇烈地搖動反應管,，開蓋時、吸樣時及污染進樣的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染,。據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題,。聚合酶鏈式反應中兩個引物之間不應存在互補序列,，尤其是避免3 ′端的互補重疊。

序列標簽站點是一個過程,，其中PCR被用作基因組的特定片段存在于特定克隆中的指示物,。人類基因組計劃發(fā)現(xiàn)這一應用對于繪制他們測序的粘粒克隆以及協(xié)調(diào)不同實驗室的結果至關重要,。聚合酶鏈反應的一個令人興奮的應用是對來自遠古來源的DNA進行系統(tǒng)進化分析,，例如在尼安德特人的復原骨骼中、從猛犸的冷凍組織中或從埃及木乃伊的大腦中發(fā)現(xiàn)的DNA已經(jīng)被放大和測序,。]在某些情況下,，這些來源的高度降解的DNA可能在擴增的早期階段重新組裝。聚合酶鏈反應的一個常見應用是對以下基因表達模式的研究,。組織(甚至單個細胞)可以在不同階段進行分析,，以了解哪些基因變得活躍，哪些基因被關閉,。該應用還可以使用定量聚合酶鏈反應來定量表達的實際水平,。許多疾病的未知病因的測序正在通過聚合酶鏈反應得到解決。武漢分子生物學RT-PCR檢測技術研究方案

像所有酶一樣,，DNA聚合酶也容易出錯,，這反過來會導致產(chǎn)生的PCR片段發(fā)生突變。溫州細胞數(shù)字PCR供應商

聚合酶鏈式反應：1976年,，中國科學家,，發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術發(fā)展也做出了基礎性貢獻,。PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈,，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合，標本核酸模板在提取過程中,，由于吸樣污染導致標本間污染,；有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散再調(diào)溫度至DNA聚合酶很適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈,?；诰酆厦钢圃斓腜CR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度,，復性溫度,，延伸溫度之間很好地進行控制,。溫州細胞數(shù)字PCR供應商