聚合酶鏈式反應：DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈,，在DNA聚合酶的參與下,，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發(fā)現,，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈,。因此,，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物,，DNA聚合酶,、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。但是,，DNA聚合酶在高溫時會失活,，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,，不但操作煩瑣,，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發(fā)展,。耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發(fā)現對于PCR的應用有里程碑的意義,，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶,，使PCR技術變得非常簡捷,、同時也降低了成本，PCR技術得以大量應用,，并逐步應用于臨床,。熱啟動聚合酶鏈式反應：一種在PCR的初始建立階段減少非特異性擴增的技術。武漢實時定量PCR網站

聚合酶鏈式反應的步驟：標準的PCR過程分為三步：DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下,，氫鍵斷裂,，形成單鏈DNA；退火：（60℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低,，引物與DNA模板結合,，形成局部雙鏈。延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性很好）的作用下,，以dNTP為原料,，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈,。每一循環(huán)經過變性,、退火和延伸，DNA含量即增加一倍?，F在有些PCR因為擴增區(qū)很短,，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法,，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行,。廣州組織Real-time PCR聚合酶鏈式反應中的DMSO、甘油等,，主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結構,。

聚合酶鏈反應的常見問題分析與解決方法：無擴增條帶：酶失活或在反應體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運輸不當而失活,，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結果,。模板含有雜質。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸,，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結果,。變性溫度是否準確：PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符，過高酶在前幾個循環(huán)就迅速失活,；過低則模板變性不徹底,。反應系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶，應在未加Taq酶以前,，將反應體系95℃加熱5-10 min,。引物變質失效。人工合成的引物是否正確,。是否純化,，或因儲存條件不當而失活。引物錯誤,。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物,。 DNA凝膠電泳時加入陽性對照，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題,。

聚合酶鏈式反應：RNA和DNA的五碳糖,，前者比后者多了一個O，由于多出來的O原子造成了RNA和DNA的堿基不同,，即O原子造成U和T的不同,，U分子化學式C4H4N2O2,，T胸腺嘧啶化學式C5H6N2O2，現在將兩個分子式進行對比,，U比T多了CH2,，結合前面的核糖區(qū)別，還有一個O分子,，其余結構相同,，那么O和CH2之間的聯系是什么?是什么導致DNA和RNA的區(qū)別是RNA比DNA多了O和CH2？或者說如何將病毒的堿基中U變成DNA堿基中的T,？若從結構上說,，直接從U中加入一個CH2，得到了T,，這里面介入化學鍵的斷裂和重組,，但是這樣一來的話，即使U變成了T,，但是核糖依舊是RNA比DNA多了一個O分子,，只是此時結構是某分子=核糖（C4H9O4CHO）+堿基（A T G C），形成了RNA的五碳糖+DNA的堿基這種分子了,。此時將這種分子導入受體細胞（亦或者蛋白質）中，表達的性質一定不同于病毒表達的性質,。嵌套式PCR在特異性擴增長DN段方面通常比傳統(tǒng)PCR更成功,，但它需要更詳細的目標序列知識。

PCR的反應條件：dNTP濃度過高會加快反應速度,，但同時還可以增加堿基的錯誤摻入率,。引物濃度過高會引起錯配和非特異性產物擴增。TaqDNA聚合酶濃度過高會引起錯配和非特異性產物擴增,，低則合成產物量減少,。TaqDNA聚合酶無校正功能，摻入錯誤率達2*E-4個核苷酸,，一個30個循環(huán)的擴增反應0.1%-0.25%總錯誤率,。在90～95度下可使整個基因組的DNA變性為單鏈。一般94～95度30～60s,。時間過長使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多,。DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結合。引物長度在15～25時退火溫度,。聚合酶鏈式反應是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術,。廣州組織Real-time PCR

嵌套聚合酶鏈反應：通過減少DNA非特異性擴增的背景，提高DNA擴增的特異性,。武漢實時定量PCR網站

聚合酶鏈反應：多重連接依賴探針擴增（MLPA):允許用單個引物對擴增多個靶標,，從而避免多重PCR的分辨率限制,。多重聚合酶鏈反應:由單個PCR混合物中的多個引物組組成，以產生對不同DNA序列特異的不同大小的擴增子,。通過同時靶向多個基因,，可以從單次測試中獲得額外的信息，否則將需要幾次試劑和更多時間來執(zhí)行,。每個引物組的退火溫度必須優(yōu)化,，以在單個反應中正確工作，并符合擴增子尺寸,。也就是說,，當通過凝膠電泳可視化時，它們的堿基對長度應該足夠不同以形成不同的條帶,。武漢實時定量PCR網站

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