聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶,。非特異性條帶的出現(xiàn),，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體,。二是Mg2+離子濃度過高,、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān),。其次是酶的質(zhì)和量,，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,。其對策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物,。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量,，適當(dāng)增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93℃變性,，65℃左右退火與延伸）?，F(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成,。南通組織PCR檢測技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑,。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下,，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝,。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈,，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈,。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性,，加入設(shè)計(jì)引物,，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制,。但是,，DNA聚合酶在高溫時(shí)會失活，因此,，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,，不但操作煩瑣,，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展,。耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發(fā)現(xiàn)對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義,，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶,，使PCR技術(shù)變得非常簡捷,、同時(shí)也降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用,，并逐步應(yīng)用于臨床,。南通微量熒光定量PCR聚合酶鏈反應(yīng)可以用于分析病癥、微生物或其他疾病狀態(tài)中基因表達(dá)水平的變化,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失,，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,，其PCR擴(kuò)增是不會成功的,。假陽性：出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊,，亮度更高,。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列,。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性,。需重新設(shè)計(jì)引物,。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差,，dNTP濃度過高,，Mg2+濃度過高，退火溫度過低,，循環(huán)次數(shù)過多引起,。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶,。②減少dNTP的濃度,。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù),。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：10×擴(kuò)增緩沖液、4種dNTP混合物（終濃度）、引物（終濃度）,、模板DNA、Taq DNA聚合酶,、Mg2+（終濃度）,、補(bǔ)加雙蒸水等。其中dNTP,、引物,、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或濃度）可根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整,，以上表格只提供大致參考值,。PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物(PCR引物為DN段，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈）,、酶,、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）,。引物有多種設(shè)計(jì)方法,，由PCR在實(shí)驗(yàn)中的目的決定，但基本原則相同,。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的DMSO,、甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu),。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DN段的分子生物學(xué)技術(shù),，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的很大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加,。因此,，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸,，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā),、皮膚或血液，只要能分離出一丁點(diǎn)的DNA,，就能用PCR加以放大,，進(jìn)行比對。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在,。由1983年美國首先提出設(shè)想,，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)，即簡易DNA擴(kuò)增法,，意味著PCR技術(shù)的真正誕生,。到2013年，PCR已發(fā)展到第三代技術(shù)。聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長移液器吸頭的移液器,。南通實(shí)時(shí)數(shù)字PCR原理

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑,。南通組織PCR檢測技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴(kuò)增法,。PCR技術(shù)類似于DNA的天然復(fù)制過程,，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR能快速特異擴(kuò)增任何已知目的基因或DN段,，并能輕易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因擴(kuò)增達(dá)到納克,、微克、毫克級的特異性DN段,。因此,，PCR技術(shù)一經(jīng)問世就被迅速而較廣地用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域?！‘惓＝Y(jié)果： 各種疾病所致的異常,，例如梅毒。一期梅毒,。即硬下疳 ,，潛伏期2-4周，外生殖器部位發(fā)生暗紅色硬腫塊 ,、淺潰瘍 ,，有軟骨樣硬度，周圍淋巴結(jié)腫大,。二期梅毒,。在一期梅毒 1-2 個(gè)月之后,，全身皮膚,、粘膜發(fā)生對稱泛發(fā)皮疹、斑疹,、,、疹等。粘膜可發(fā)生粘膜斑,、扁平濕疣,，傳染性強(qiáng)。三期梅毒,。發(fā)生在染上后2-3年乃至10年，皮膚為樹膠樣腫,，還可涉及骨,、關(guān)節(jié),、心、血管,，表現(xiàn)為主動脈炎,、主動脈瓣閉鎖不全和主動脈瘤等，侵及神經(jīng)為脊髓癆 ,，全身麻痹 ( 麻痹性癡呆 )等等,。　需要檢查的人群：疑似某種特定的疾病病人,，進(jìn)行分子特異性檢查。南通組織PCR檢測技術(shù)

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