聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)的基本原理類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物,。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后,，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈,，以便它與引物結(jié)合,，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,，溫度降至55℃左右,，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在72℃,、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下,，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板,，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理,，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍,。如果基因的基因組DNA序列是已知的,，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)可以用來(lái)繪制基因中外顯子和內(nèi)含子的位置。廈門(mén)分子生物學(xué)數(shù)字PCR研究方案

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗(yàn)污染：實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染：在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照的檢驗(yàn)室,，這個(gè)問(wèn)題也比較常見(jiàn),。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過(guò)程中需用較多的用具及試劑,，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒,，由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力。其污染可能性也很大,。污染的監(jiān)測(cè)：一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室,，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè)，考慮有無(wú)污染是什么原因造成的污染,，以便采取措施,，防止和消除污染。重復(fù)性試驗(yàn)。選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,。廈門(mén)分子生物學(xué)數(shù)字PCR研究方案聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：PCR所用的酶主要有兩種來(lái)源：Taq和Pfu,，分別來(lái)自?xún)煞N不同的噬熱菌。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：PCR引物設(shè)計(jì)：PCR反應(yīng)中有兩條引物,，即5′端引物和3′引物,。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上的一小段DNA序列相同,；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ),。引物設(shè)計(jì)的基本原則：引物長(zhǎng)度：15-30bp,，常用為20bp左右,。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳,，G+C 過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC很好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：1976年,，中國(guó)科學(xué)家，發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶,，為PCR技術(shù)發(fā)展也做出了基礎(chǔ)性貢獻(xiàn),。PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合,，標(biāo)本核酸模板在提取過(guò)程中,，由于吸樣污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散再調(diào)溫度至DNA聚合酶很適反應(yīng)溫度（72°C左右）,，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈,。基于聚合酶制造的PCR儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備,，能在變性溫度,，復(fù)性溫度，延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制,。嵌套聚合酶鏈反應(yīng)的兩組引物用于兩個(gè)連續(xù)的PCR,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題：陰性：需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量,、引物的濃度,、兩條引物的濃度是否對(duì)稱(chēng)，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想,、容易彌散的常見(jiàn)原因,。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低,，造成低效率的不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增,，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不但要看OD值,，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,，如一條引物有條帶,，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗,，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決,。如一條引物亮度高，一條亮度低,，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度,。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分,，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效,。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠,，引物之間形成二聚體等,。重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)可以將缺失、插入或點(diǎn)突變引入DNA序列,。廣州骨頭Real-time PCR研究方案

熱啟動(dòng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可以通過(guò)將反應(yīng)組分加熱到變性溫度在加入聚合酶之前,。廈門(mén)分子生物學(xué)數(shù)字PCR研究方案

聚合酶鏈反應(yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題分析與解決方法：擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶)：引物用量偏大，引物的特異性不高,。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量,。循環(huán)的次數(shù)過(guò)多。適當(dāng)增加模板的量,，減少循環(huán)次數(shù),。酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶,。退火溫度偏低,，退火及延伸時(shí)間偏長(zhǎng)。應(yīng)提高退火溫度,，減少變性與延伸時(shí)間,，也可采用二種溫度的PCR擴(kuò)增。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度,。 樣品處理不當(dāng),。Mg2+濃度偏高，因適當(dāng)調(diào)整Mg2+使用濃度。若為PCR試劑盒,，也可能時(shí)試劑盒本身質(zhì)量有問(wèn)題,。復(fù)制提前終止。使用非熱啟動(dòng)的聚合酶時(shí)常有發(fā)生,。冰上準(zhǔn)備反應(yīng)體系或采用熱啟動(dòng)聚合酶,。廈門(mén)分子生物學(xué)數(shù)字PCR研究方案

上海司鼎生物科技有限公司發(fā)展規(guī)模團(tuán)隊(duì)不斷壯大，現(xiàn)有一支專(zhuān)業(yè)技術(shù)團(tuán)隊(duì),，各種專(zhuān)業(yè)設(shè)備齊全,。在司鼎生物近多年發(fā)展歷史，公司旗下現(xiàn)有品牌司鼎;OriCell等,。公司以用心服務(wù)為重點(diǎn)價(jià)值,，希望通過(guò)我們的專(zhuān)業(yè)水平和不懈努力，將從事生物科技領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)開(kāi)發(fā),、技術(shù)轉(zhuǎn)讓,、技術(shù)咨詢(xún),、技術(shù)服務(wù),，營(yíng)養(yǎng)健康咨詢(xún)服務(wù)，商務(wù)咨詢(xún),，計(jì)算機(jī)軟件開(kāi)發(fā),，化工原料及產(chǎn)品（除危險(xiǎn)化學(xué)品、監(jiān)控化學(xué)品,、煙花爆竹,、易制毒化學(xué)品），實(shí)驗(yàn)室設(shè)備,，儀表儀器的銷(xiāo)售,。 【依法須經(jīng)批準(zhǔn)的項(xiàng)目，經(jīng)相關(guān)部門(mén)批準(zhǔn)后方可開(kāi)展經(jīng)營(yíng)活動(dòng)】等業(yè)務(wù)進(jìn)行到底,。自公司成立以來(lái),，一直秉承“以質(zhì)量求生存，以信譽(yù)求發(fā)展”的經(jīng)營(yíng)理念,，始終堅(jiān)持以客戶(hù)的需求和滿(mǎn)意為重點(diǎn),，為客戶(hù)提供良好的免疫印跡（WB)技術(shù)服務(wù)，熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),，膜片鉗電生理技術(shù)服務(wù),，在體光纖成像記錄技術(shù)服務(wù)，從而使公司不斷發(fā)展壯大,。