聚合酶鏈反應(yīng)：流聚合酶鏈反應(yīng):一種偽等溫PCR方法。將溶液置于熱梯度下,，而不是反復(fù)加熱和冷卻聚合酶鏈反應(yīng)混合物,。由此產(chǎn)生的熱不穩(wěn)定性驅(qū)動(dòng)對(duì)流流動(dòng)自動(dòng)將聚合酶鏈反應(yīng)試劑從熱區(qū)域和冷區(qū)域打亂，從而反復(fù)啟動(dòng)聚合酶鏈反應(yīng),。通過(guò)利用混沌流場(chǎng)的出現(xiàn),，可以優(yōu)化熱邊界條件和PCR外殼的幾何形狀等參數(shù)，以產(chǎn)生特異和快速的PCR,。這種對(duì)流聚合酶鏈反應(yīng)設(shè)置明顯降低了設(shè)備功率需求和操作時(shí)間,。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)):用于從RNA中擴(kuò)增DNA。逆轉(zhuǎn)錄酶將核糖核酸逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ,，然后通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增,。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)較廣用于表達(dá)譜，以確定基因的表達(dá)或鑒定RNA轉(zhuǎn)錄物的序列,，包括轉(zhuǎn)錄起始和終止位點(diǎn),。如果基因的基因組DNA序列是已知的,，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)可以用來(lái)繪制基因中外顯子和內(nèi)含子的位置?；虻?’端(對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))通常通過(guò) RACE-PCR (快速擴(kuò)增cDNA末端)中,。聚合酶鏈反應(yīng)非常敏感，有可能產(chǎn)生數(shù)百萬(wàn)到數(shù)十億份特定產(chǎn)品的拷貝,，用于測(cè)序,、克隆和分析。南通實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)網(wǎng)站

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：PCR引物設(shè)計(jì)：PCR反應(yīng)中有兩條引物,，即5′端引物和3′引物,。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上的一小段DNA序列相同,；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ),。引物設(shè)計(jì)的基本原則：引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右,。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC很好隨機(jī)分布,，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。杭州分子生物學(xué)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)電子PCR被提出作為分子生物學(xué)的教育工具,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的步驟：標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程分為三步：DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下,，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA,；退火：（60℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低,，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈,。延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右,，活性很好）的作用下，以dNTP為原料,，從引物的3′端開(kāi)始以從5′→3′端的方向延伸,，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性,、退火和延伸,，DNA含量即增加一倍。現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短,，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成,，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題：PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以內(nèi),，有些很好于當(dāng)日電泳檢測(cè),，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。假陰性：不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶,。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備,，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及溴乙錠的使用,， PCR循環(huán)條件,。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板：模板中含有雜蛋白質(zhì),，模板中含有Taq酶抑制劑,，模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈,，特別是染色體中的組蛋白,，在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚,。模板核酸變性不徹底,。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,，極有可能是標(biāo)本的消化處理,，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改,。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)較廣用于表達(dá)譜，以確定基因的表達(dá)或鑒定RNA轉(zhuǎn)錄物的序列,。

聚合酶鏈反應(yīng)同時(shí)擴(kuò)增單個(gè)精子中幾個(gè)基因座的能力]增強(qiáng)了極大地增強(qiáng)了通過(guò)研究減數(shù)分裂后染色體交叉來(lái)進(jìn)行基因定位的傳統(tǒng)任務(wù),。通過(guò)分析數(shù)千個(gè)單個(gè)精子，已經(jīng)直接觀察到非常緊密基因座之間罕見(jiàn)的交叉事件,。類似地,，可以分析異常的缺失、插入,、易位或倒位,，所有這些都無(wú)需等待(或支付)漫長(zhǎng)而艱苦的受精、胚胎發(fā)生等過(guò)程,。定點(diǎn)突變：聚合酶鏈反應(yīng)可用于產(chǎn)生突變基因,，突變由科學(xué)家隨意選擇?？梢赃x擇這些突變來(lái)理解蛋白質(zhì)是如何完成其功能的,，并改變或改善蛋白質(zhì)功能。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng))：用于從RNA中擴(kuò)增DNA,。南京分子生物學(xué)Real-time PCR原理

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列,。南通實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)網(wǎng)站

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