聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)又稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),，是一項(xiàng)利用DNA雙鏈復(fù)制的原理,，在生物體外復(fù)制特定DN段的核酸合成技術(shù)。透過(guò)這項(xiàng)技術(shù),，可在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因,，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。聚合酶鏈反應(yīng)是是一種簡(jiǎn)單,，廉價(jià)和可靠的方法復(fù)制DN段,，這個(gè)概念適用于現(xiàn)物學(xué)和相關(guān)科學(xué)的許多領(lǐng)域。 PCR可能是分子生物學(xué)中使用很較廣的技術(shù),。這種技術(shù)被用于生物醫(yī)學(xué)研究,，犯罪取證和分子考古學(xué)。通常,，PCR由一系列20-40次重復(fù)的溫度變化組成,，稱為熱循環(huán)，每個(gè)循環(huán)通常由兩個(gè)或三個(gè)離散的溫度步驟組成,。PCR的很大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加?；窗卜肿由飳W(xué)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：PCR所用的酶主要有兩種來(lái)源：Taq和Pfu,，分別來(lái)自兩種不同的噬熱菌,。其中Taq擴(kuò)增效率高但易發(fā)生錯(cuò)配。Pfu擴(kuò)增效率弱但有糾錯(cuò)功能,。所以實(shí)際使用時(shí)根據(jù)需要必須做不同的選擇。模板即擴(kuò)增用的DNA,，可以是任何來(lái)源，但有兩個(gè)原則,，純度必須較高，第二濃度不能太高以免抑制,。緩沖液的成分很為復(fù)雜，除水外一般包括四個(gè)有效成分：緩沖體系,，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；一價(jià)陽(yáng)離子,，一般采用鉀離子,，但在特殊情況下也可使用銨根離子；二價(jià)陽(yáng)離子,，即鎂離子，根據(jù)反應(yīng)體系確定,，除特殊情況外不需調(diào)整,；輔助成分,，常見的有DMSO、甘油等,，主要用來(lái)保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu),。無(wú)錫分子生物學(xué)Real-time PCR供應(yīng)商聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物,。

現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成,，因此可以改為兩步法,，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過(guò)程,，提高了反應(yīng)速度,。檢測(cè)：PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù),，下一步檢測(cè)就成了關(guān)鍵,。熒光素（溴化乙錠,，EB）染色凝膠電泳是很常用的檢測(cè)手段。電泳法檢測(cè)特異性是不太高的,，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因?yàn)槠浜?jiǎn)捷易行,，成為了主流檢測(cè)方法。近年來(lái)以熒光探針為的檢測(cè)方法,，有逐漸取代電泳法的趨勢(shì)。

基于聚合酶鏈反應(yīng)的遺傳(或脫氧核糖核酸)指紋圖譜協(xié)議的發(fā)展已在法醫(yī)學(xué)中得到較廣應(yīng)用：遺傳指紋以其辨別力的形式,，可以從世界上所有人群中獨(dú)特地區(qū)分任何一個(gè)人。微小的DNA樣本可以從犯罪現(xiàn)場(chǎng),，和比較的從嫌疑人那里,，或者從DNA資料庫(kù)早期的證據(jù)或罪犯。這些測(cè)試的簡(jiǎn)單版本通常用于在刑事調(diào)查中快速排除嫌疑人,。幾十年前的犯罪證據(jù)可以被檢驗(yàn)，確認(rèn)或免責(zé)很初被定罪的人,。脫氧核糖核酸指紋中較小的區(qū)別有助于親子鑒定,，在親子鑒定中，一個(gè)人和他的近親相匹配?？梢詼y(cè)試未知人類遺骸的DNA,，并與可能的父母,、兄弟姐妹或兒童進(jìn)行比較。類似的測(cè)試可以用來(lái)確認(rèn)被收養(yǎng)(或)孩子的親生父母,。新生兒的實(shí)際生父也可以被確認(rèn)(或排除),。PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以內(nèi)，有些很好于當(dāng)日電泳檢測(cè),，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。

PCR的反應(yīng)條件：dNTP濃度過(guò)高會(huì)加快反應(yīng)速度,，但同時(shí)還可以增加堿基的錯(cuò)誤摻入率,。引物濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。TaqDNA聚合酶濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增,，低則合成產(chǎn)物量減少,。TaqDNA聚合酶無(wú)校正功能，摻入錯(cuò)誤率達(dá)2*E-4個(gè)核苷酸,，一個(gè)30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)0.1%-0.25%總錯(cuò)誤率,。在90～95度下可使整個(gè)基因組的DNA變性為單鏈。一般94～95度30～60s,。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多,。DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結(jié)合。引物長(zhǎng)度在15～25時(shí)退火溫度,。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)較廣用于表達(dá)譜,，以確定基因的表達(dá)或鑒定RNA轉(zhuǎn)錄物的序列。南通微量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)技術(shù)服務(wù)

聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長(zhǎng)移液器吸頭的移液器,?；窗卜肿由飳W(xué)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊,。引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過(guò)70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列,，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增,。引物3‘端的堿基,，特別是很末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),，很好選擇是G和C,。引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn),，引入突變位點(diǎn),，用生物素、熒光物質(zhì),、地高辛標(biāo)記,，加入其它短序列，包括起始密碼子,、終止密碼子等,。淮安分子生物學(xué)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)

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