Real-time PCR從用途上分可以分為定性分析和定量分析：定性分析指的是用于分析待檢測的樣本中是否存在我們想要檢測的成分,，即待檢測成分有無的分析。通常,，定性分析可以應(yīng)用于病毒以及病原菌的檢測,，物種鑒定以及基因分型等,。病毒及病原菌檢測，如SARS,、H1N1病毒,，都可以通過Real-time PCR的方法進(jìn)行高靈敏度的檢測，定性分析樣本是否已被病毒傳播,。物種鑒定如我們國家的一些檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu),，想要檢測進(jìn)口的牛肉制品中是否含有雞源、豬源或鴨源等成分,，或者用于檢測羊奶中是否會(huì)摻有牛奶等等,，可以通過Real-time PCR的方法進(jìn)行檢測?；蚍中?，如啤酒型，肥胖型基因的檢測,，就是Real-time PCR在基因分型方面的應(yīng)用,。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。無錫組織PCR檢測技術(shù)設(shè)計(jì)公司

引物的設(shè)計(jì)對于這個(gè)實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要,，因?yàn)镽eal-time PCR的檢測靈敏度比較高,，所以相應(yīng)的對引物設(shè)計(jì)的要求就很高,。普通的要求規(guī)則大家都知道,，還有幾點(diǎn)必須注意：1，引物的錯(cuò)配率（引物錯(cuò)配形成引物二聚體,，但是SYBR照樣能嵌入進(jìn)去,，結(jié)果導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差很大，重復(fù)性也不好）,。2,，引物的特異性一定要高（不像常規(guī)PCR，引物同源性不高,，只要兩條產(chǎn)物的片段長度相差足夠大,，在電泳的時(shí)候能夠區(qū)分開就可以。Real-time PCR只有在熔解曲線的時(shí)候能分開,，所以這就造成整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差很大,，不可信）。無錫組織PCR檢測技術(shù)設(shè)計(jì)公司PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成,。

Real-time PCR操作流程：1,、收集樣品。2相關(guān)試劑總RNA提取試劑TREzolReagent(RNA提取試劑),M-MLV（cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶）,RNA純化試劑,RealqPCRMasterMix（螢光定量PCR預(yù)混試劑）,。3實(shí)驗(yàn)儀器螢光定量PCR儀;PCR儀,；低溫離心機(jī),。4總RNA提取。5cDNA合成在0.5ml的離心管中加入1µl模板總RNA（1µg/µl）,；Real-time PCR操作流程：2µl隨機(jī)引物（T18,10pmol/ul）,；2µl10mMdNTPmix；加水至15µl體系,?；靹蚝?0℃變性RNA5分鐘，冰上速冷1分鐘,，離心將溶液收集至管底加入6µl5×PCRbuffer,；1µlRNaseout；1µlM-MLVRT,；加水至30µl體系,。PCR儀中反應(yīng)條件設(shè)定37℃延伸60min，70℃保溫15min終止反應(yīng),。合成好的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DN段的分子生物學(xué)技術(shù),，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的很大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加,。因此,，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸,，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā),、皮膚或血液，只要能分離出一丁點(diǎn)的DNA,，就能用PCR加以放大,，進(jìn)行比對。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在,。發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng),，即簡易DNA擴(kuò)增法，意味著PCR技術(shù)的真正誕生,。到2013年,，PCR已發(fā)展到第三代技術(shù)。Real-time PCR與普通PCR的實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，所以對引物的設(shè)計(jì)要求也不同,。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度,，并記錄在電腦軟件之中,，通過對每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果,。因此,，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí),，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大,，因此Ct值的重現(xiàn)性極好,，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的,。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量方法,，在Real-time PCR中，模板定量有兩種策略,。無錫組織PCR檢測技術(shù)設(shè)計(jì)公司

PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結(jié)合,。無錫組織PCR檢測技術(shù)設(shè)計(jì)公司

Real-time PCR鏈反應(yīng)注意事項(xiàng)：在實(shí)驗(yàn)過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性,。在總RNA的提取過程中,，注意避免mRNA的斷裂；為了防止非特異性擴(kuò)增,，必須設(shè)陰性對照,；內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）,、β-Actin（β-肌動(dòng)蛋白）等,。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差,；PCR不能進(jìn)入平臺期,，出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長度、序列,、二級結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān),。故對于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來確定,；防止DNA的污染：采用DNA酶處理RNA；在可能的情況下,，將PCR引物置于基因的不同外顯子,，以消除基因和mRNA的共線性。無錫組織PCR檢測技術(shù)設(shè)計(jì)公司

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