Real-time PCR相對定量中的標準曲線法如何進行：主要是相對定量標準品的制作,，一般有三種方法：1、比較復雜的方法：質(zhì)粒,，采用Biotnt提供內(nèi)參基因的特異性Real-time PCRmRNA引物,，對目的基因進行Real-time PCR實驗，得到PCR擴增產(chǎn)物,；PCR擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)入質(zhì)粒中,，得到相對定量的標準品；2,、一般采用的方法1：比較強的CDNA模板,，3、一般采用的方法：PCR擴增產(chǎn)物,，如果在方法2中找不到比較強的CDNA模板,，則選用PCR產(chǎn)物作為相對定量的標準品也是可以的；需要注意的事項是：PCR產(chǎn)物濃度很高,，而Real-time PCR的產(chǎn)物片段比較短,，容易在稀釋的過程中造成PCR污染，要注意操作,。所謂實時熒光定量PCR技術,，是指在PCR反應體系中加入熒光基團。深圳分子生物學RT-PCR檢測技術服務

Real-time PCR鏈反應：嵌套聚合酶鏈反應:通過減少DNA非特異性擴增的背景,，提高DNA擴增的特異性,。兩組引物用于兩個連續(xù)的PCR,。在個反應中，一對引物用于產(chǎn)生DNA產(chǎn)物,，除了預期的靶之外,，該產(chǎn)物可能仍然由非特異性擴增的DN段組成。然后用一組引物將產(chǎn)物用于第二次聚合酶鏈反應,，所述引物的結合位點完全或部分不同于次反應中使用的每個引物,，并且位于其中的3’。嵌套式PCR在特異性擴增長DN段方面通常比傳統(tǒng)PCR更成功,，但它需要更詳細的目標序列知識,。重疊延伸聚合酶鏈反應或者通過重疊延伸拼接(SOEing):一種用于將兩個或多個含有互補序列的DN段拼接在一起的基因工程技術。它用于連接含有基因,、調(diào)節(jié)序列或突變的DN段,；這項技術可以創(chuàng)造特定的長DNA構建體。它還可以將缺失,、插入或點突變引入DNA序列,。分子生物學數(shù)字PCR在嵌套聚合酶鏈反應中，除了預期的靶之外,，該產(chǎn)物可能仍然由非特異性擴增的DN段組成,。

Real-time PCR反應：多重連接依賴探針擴增（MLPA):允許用單個引物對擴增多個靶標,，從而避免多重PCR的分辨率限制,。多重聚合酶鏈反應:由單個PCR混合物中的多個引物組組成,，以產(chǎn)生對不同DNA序列特異的不同大小的擴增子。通過同時靶向多個基因,，可以從單次測試中獲得額外的信息,，否則將需要幾次試劑和更多時間來執(zhí)行,。每個引物組的退火溫度必須優(yōu)化,，以在單個反應中正確工作，并符合擴增子尺寸,。也就是說,，當通過凝膠電泳可視化時,，它們的堿基對長度應該足夠不同以形成不同的條帶,。

為了便于對所檢測樣本進行比較,，在real-timeQ-PCR反應的指數(shù)期，首先需設定一定熒光信號的域值,，一般這個域值（threshold）是以PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號（baseline）,，熒光域值的缺省設置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍,。如果檢測到熒光信號超過域值被認為是真正的信號,，它可用于定義樣本的域值循環(huán)數(shù)（Ct）,。Ct值的含義是：每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明,，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系,，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小,。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線,，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù),?；谔结樀幕瘜W法，Real-time PCR應用一個或多個熒光標記的寡核苷酸探針檢測PCR擴增產(chǎn)物,。

Real-time PCR式反應準備：10×擴增緩沖液,、4種dNTP混合物（終濃度）、引物（終濃度）,、模板DNA,、TaqDNA聚合酶、Mg2+（終濃度）,、補加雙蒸水等,。其中dNTP、引物,、模板DNA,、TaqDNA聚合酶以及Mg2+的加量（或濃度）可根據(jù)實驗調(diào)整，以上表格只提供大致參考值,。PCR反應五要素：參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即：引物(PCR引物為DN段,，細胞內(nèi)DNA復制的引物為一段RNA鏈）、酶,、dNTP,、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）。引物有多種設計方法,，由PCR在實驗中的目的決定,，但基本原則相同,。Real-time PCR包括病原微生物或病毒含量的檢測。深圳分子生物學RT-PCR檢測技術服務

因為Real-time PCR的檢測靈敏度比較高,，所以相應的對引物設計的要求就很高,。深圳分子生物學RT-PCR檢測技術服務

Real-time PCR實驗常用的RNA酶抑制劑：1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結合使蛋白質(zhì)變性,，從而抑制酶的活性,。2.異硫氰酸胍：目前被認為是較有效的RNA酶抑制劑,，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活,。它既可破壞細胞結構使核酸從蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用,。3.氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物,，它和RNA酶結合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性,。4.RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白,。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合,，使其失活,。5.其它：SDS、尿素,、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用,。深圳分子生物學RT-PCR檢測技術服務

上海司鼎生物科技有限公司是一家從事生物科技領域內(nèi)的技術開發(fā)、技術轉(zhuǎn)讓,、技術咨詢,、技術服務，營養(yǎng)健康咨詢服務,，商務咨詢,，計算機軟件開發(fā)，化工原料及產(chǎn)品（除危險化學品,、監(jiān)控化學品,、煙花爆竹、易制毒化學品）,，實驗室設備,，儀表儀器的銷售。 【依法須經(jīng)批準的項目,，經(jīng)相關部門批準后方可開展經(jīng)營活動】的公司,，致力于發(fā)展為創(chuàng)新務實、誠實可信的企業(yè),。司鼎生物深耕行業(yè)多年,，始終以客戶的需求為向?qū)?，為客戶提供高質(zhì)量的免疫印跡（WB)技術服務，熒光定量PCR技術服務,，膜片鉗電生理技術服務,，在體光纖成像記錄技術服務。司鼎生物不斷開拓創(chuàng)新,，追求出色,，以技術為先導，以產(chǎn)品為平臺,，以應用為重點,，以服務為保證，不斷為客戶創(chuàng)造更高價值,，提供更優(yōu)服務,。司鼎生物創(chuàng)始人丁榮芳，始終關注客戶,，創(chuàng)新科技,，竭誠為客戶提供良好的服務。