Real-time PCR螢光染料摻入法:在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR螢光染料,，SYBR螢光染料特異性地摻入DNA雙鏈后,，發(fā)射螢光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何螢光信號,，從而保證螢光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步,。此方法適用于：1,、靈敏度高：使用SYBR可使螢光效果增強到1000倍以上。2,、通用性好,不需要設(shè)計探針,方法簡便,省時,價格低廉,。3、通用型方法,，在國內(nèi)外科研中普遍使用,。4、高通量大規(guī)模的定量PCR檢測,。5,、專一性要求不高的定量PCR檢測。聚合酶鏈式反應(yīng)：模板的制備,，PCR的模板可以是DNA,，也可以是RNA。徐州細胞Real-time PCR方案

聚合酶鏈式反應(yīng)的試驗污染：陽性對照,，在建立PCR反應(yīng)實驗室及一般的檢驗單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照,，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志,。陽性對照要選擇擴增度中等,、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本,，如以重組質(zhì)粒為陽性對照,，其含量宜低不宜高（100個拷貝以下）。但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標本,，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大,。因而當某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定。徐州細胞Real-time PCR方案聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長移液器吸頭的移液器,。

Real-time PCR：所謂Real-time PCR技術(shù),，是指在PCR反應(yīng)體系中加入螢光基團，利用螢光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程,，之后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法,。利用螢光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化,，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析,。Real-time PCR技術(shù)即實時螢光定量PCR避免了傳統(tǒng)PCR以終產(chǎn)物監(jiān)測定量產(chǎn)生的偏差，提高實驗的重複性,。該技術(shù)已經(jīng)被普遍用于監(jiān)測細胞mRNA表達量的變化,；比較不同組織的mRNA表達差異；驗證基因晶片,，siRNA干擾的實驗結(jié)果,。

所謂real-timeQ-PCR技術(shù),，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程,，之后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法,。在real-time技術(shù)的發(fā)展過程中，兩個重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用：（1）TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn),，它能降解特異性熒光記探針,，因此使得間接的檢測PCR產(chǎn)物成為可能。（2）此后熒光雙標記探針的運用使在一密閉的反應(yīng)管中能實時地監(jiān)測反應(yīng)全過程,。這兩個發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的運用,。聚合酶鏈式反應(yīng)可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制。

Real-time PCR-傳統(tǒng)定量PCR：1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標和引物,，內(nèi)標用基因工程方法合成,。上游引物用熒光標記，下游引物不標記,。在模板擴增的同時,，內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中,，由于內(nèi)標與靶模板的長度不同,，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度,，以內(nèi)標為對照定量待檢測模板,。2）競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中,，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）,。多重連接依賴探針擴增允許用單個引物對擴增多個靶標，從而避免多重PCR的分辨率限制,。上海實時熒光定量PCR網(wǎng)站

聚合酶鏈式反應(yīng)的模板的取材主要依據(jù)PCR的擴增對象,，可以是病原體標本如病毒、細菌,、菌類等,。徐州細胞Real-time PCR方案

內(nèi)標在傳統(tǒng)定量中的作用，由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測,，即PCR到達平臺期后進行檢測,，而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴增到達平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差,。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實驗,，所得結(jié)果有很大差異，因此無法直接從終點產(chǎn)物量推算出起始模板量,。加入內(nèi)標后,，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準確性,。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量,、粗略定量的方法,。內(nèi)標對定量PCR的影響，若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標,，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR,，雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時,，這種競爭會表現(xiàn)得更為明顯,。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標,。也正是這個原因,，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標，但仍然只是一種半定量的方法,。徐州細胞Real-time PCR方案

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