Real-timePCR的反應(yīng)條件：dNTP濃度過(guò)高會(huì)加快反應(yīng)速度，但同時(shí)還可以增加堿基的錯(cuò)誤摻入率,。引物濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增,。TaqDNA聚合酶濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，低則合成產(chǎn)物量減少,。TaqDNA聚合酶無(wú)校正功能,，摻入錯(cuò)誤率達(dá)2*E-4個(gè)核苷酸，一個(gè)30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)0.1%-0.25%總錯(cuò)誤率,。在90～95度下可使整個(gè)基因組的DNA變性為單鏈,。一般94～95度30～60s。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多,。DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結(jié)合,。引物長(zhǎng)度在15～25時(shí)退火溫度。通過(guò)使用本產(chǎn)品,，可以在更短的時(shí)間內(nèi),，簡(jiǎn)便、低成本地進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)。上海特殊樣本Real-time PCR方案

Real-time PCR探針?lè)ㄟm用于：1,、具有高適應(yīng)性和可靠性,，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定重複性好，特異性更高,。2,、適用于擴(kuò)增序列專(zhuān)一的體系的檢測(cè)。3,、樣品中靶基因含量過(guò)低的定量PCR檢測(cè)。4,、靶基因的特異序列較短,，無(wú)論怎樣較佳化引物設(shè)計(jì)條件都不能解決。5,、存在與靶基因同源的序列,，在PCR中容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，對(duì)特異性要求較高的定量,。6,、普遍用于人類(lèi)傳染病的診斷和病原定量,在動(dòng)物病原體基因的檢測(cè),畜禽產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫,生物製品的鑒定。Real-time PCR探針?lè)?PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的螢光探針,，該探針為一寡核苷酸,，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告螢光基團(tuán)和一個(gè)淬滅螢光基團(tuán)。探針完整時(shí),，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的螢光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收,；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,，使報(bào)告螢光基團(tuán)和淬滅螢光基團(tuán)分離,，從而螢光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到螢光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈,，就有一個(gè)螢光分子形成,，實(shí)現(xiàn)了螢光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。珠海分子生物學(xué)數(shù)字PCR應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中,，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法,。

Real-time PCR-傳統(tǒng)定量PCR：擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段,，而待測(cè)模板不被酶切,，可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi)，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度,，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù),。PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物,，之后酶使底物顯色,。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo),，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

聚合酶鏈反應(yīng)注意事項(xiàng)：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要防止RNA的降解,，保持RNA的完整性,。在總RNA的提取過(guò)程中，注意避免mRNA的斷裂,；為了防止非特異性擴(kuò)增,，必須設(shè)陰性對(duì)照；內(nèi)參的設(shè)定主要為了用于靶RNA的定量,。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）,、β-Actin（β-肌動(dòng)蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差,、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差,；PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期，出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長(zhǎng)度,、序列,、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對(duì)于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)的循環(huán)數(shù),，均應(yīng)通過(guò)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定,；防止DNA的污染：采用DNA酶處理RNA；在可能的情況下,，將PCR引物置于基因的不同外顯子,，以消除基因和mRNA的共線性。聚合酶鏈反應(yīng)可以選擇這些突變來(lái)理解蛋白質(zhì)是如何完成其功能的,，并改變或改善蛋白質(zhì)功能,。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的螢光探針。

引物的設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)：1,，引物設(shè)計(jì)要跨內(nèi)含子,，不能在一個(gè)外顯子上（我們的實(shí)驗(yàn)是以cDNA為模板來(lái)擴(kuò)增的，如果有DNA污染的話,，因?yàn)镈NA上含有分子量很大的內(nèi)含子,，不可能完成擴(kuò)增。這對(duì)我們消除整個(gè)實(shí)驗(yàn)的誤差起很大的作用）,。2,，引物設(shè)計(jì)的時(shí)候要盡可能設(shè)計(jì)在同一退火溫度,，方便于以后同時(shí)擴(kuò)增很多不同的基因片段。但是如果相差比較大,，就得分開(kāi)做,，浪費(fèi)模板，浪費(fèi)管家基因,，所以每個(gè)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)引物的時(shí)候要盡可能一致,，這樣就不用每次查退火溫度，且對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)有利,。因?yàn)镽eal-time PCR的檢測(cè)靈敏度比較高,，所以相應(yīng)的對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求就很高。上海特殊樣本Real-time PCR方案

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中要確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻,。上海特殊樣本Real-time PCR方案

聚合酶鏈反應(yīng)同時(shí)擴(kuò)增單個(gè)精子中幾個(gè)基因座的能力增強(qiáng)了極大地增強(qiáng)了通過(guò)研究減數(shù)分裂后染色體交叉來(lái)進(jìn)行基因定位的傳統(tǒng)任務(wù),。通過(guò)分析數(shù)千個(gè)單個(gè)精子，已經(jīng)直接觀察到非常緊密基因座之間罕見(jiàn)的交叉事件,。類(lèi)似地,，可以分析異常的缺失,、插入,、易位或倒位，所有這些都無(wú)需等待(或支付)漫長(zhǎng)而艱苦的受精,、胚胎發(fā)生等過(guò)程,。定點(diǎn)突變：聚合酶鏈反應(yīng)可用于產(chǎn)生突變基因，突變由科學(xué)家隨意選擇,?？梢赃x擇這些突變來(lái)理解蛋白質(zhì)是如何完成其功能的，并改變或改善蛋白質(zhì)功能,。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象,，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌,、菌類(lèi)等,。上海特殊樣本Real-time PCR方案

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