Real-time PCR：實時熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數(shù)較敏感,、較準確的方法,。如果用于RNA檢測，這被稱為逆轉(zhuǎn)錄實時PCR即（Real-timeRT-PCR）是實時PCR法,，它是指對DNA或經(jīng)過反轉(zhuǎn)入（RT-PCR）的RNA通過聚合酶鏈式反應(yīng)并實時監(jiān)測DNA的放大過程,，在擴增的指數(shù)增長期就測量擴增產(chǎn)物，因為擴增指數(shù)增長期測量值與特異DNA（RNA）起始量存在相關(guān)性，從而實現(xiàn)定量檢測,。Real-time PCR的基本目標是精確測量和鑒別非常微量的特異性核酸，從而可通過監(jiān)測CT值而實現(xiàn)對原始目標基因的含量定量,。實時熒光定量PCR法較大的優(yōu)點是克服了終點PCR法進入平臺期或叫飽和期后定量的較大誤差,，實現(xiàn)DNA/RNA的精確定量。該技術(shù)不單單實現(xiàn)了對DNA/RNA模板的定量,，而且具有靈敏度和特異性高,、能實現(xiàn)多重反應(yīng)、自動化程度高,、無污染,、實時和準確等特點，該技術(shù)在醫(yī)學臨床檢驗及臨床醫(yī)學研究方面有著重要的意義,。PCR可能是分子生物學中使用很較廣的技術(shù),。蘇州骨頭Real-time PCR方案

內(nèi)標在傳統(tǒng)定量中的作用，由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測,，即PCR到達平臺期后進行檢測,，而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴增到達平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差,。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實驗,，所得結(jié)果有很大差異,，因此無法直接從終點產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標后,，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準確性,。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量,、粗略定量的方法,。內(nèi)標對定量PCR的影響，若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標,，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR,，雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時,，這種競爭會表現(xiàn)得更為明顯,。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標,。也正是這個原因,，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標，但仍然只是一種半定量的方法,。揚州分子生物學熒光PCRReal-time PCR在實驗內(nèi)參的設(shè)定主要為了用于靶RNA的定量,。

Real-time PCR相對定量中的標準曲線法如何進行：主要是相對定量標準品的制作，一般有三種方法：1,、比較復(fù)雜的方法：質(zhì)粒,，采用Biotnt提供內(nèi)參基因的特異性Real-time PCRmRNA引物，對目的基因進行Real-time PCR實驗,，得到PCR擴增產(chǎn)物,；PCR擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)入質(zhì)粒中，得到相對定量的標準品,；2、一般采用的方法1：比較強的CDNA模板,，3,、一般采用的方法：PCR擴增產(chǎn)物，如果在方法2中找不到比較強的CDNA模板,，則選用PCR產(chǎn)物作為相對定量的標準品也是可以的,；需要注意的事項是：PCR產(chǎn)物濃度很高，而Real-time PCR的產(chǎn)物片段比較短,，容易在稀釋的過程中造成PCR污染,，要注意操作。

Real-time PCR探針法適用于：1,、具有高適應(yīng)性和可靠性,，實驗結(jié)果穩(wěn)定重複性好,，特異性更高。2,、適用于擴增序列專一的體系的檢測,。3、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測,。4,、靶基因的特異序列較短，無論怎樣較佳化引物設(shè)計條件都不能解決,。5,、存在與靶基因同源的序列，在PCR中容易出現(xiàn)非特異性擴增,，對特異性要求較高的定量,。6、普遍用于人類傳染病的診斷和病原定量,在動物病原體基因的檢測,畜禽產(chǎn)品的檢驗檢疫,生物製品的鑒定,。Real-time PCR探針法:PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的螢光探針,，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告螢光基團和一個淬滅螢光基團,。探針完整時,，報告基團發(fā)射的螢光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時,，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,，使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離，從而螢光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到螢光信號,，即每擴增一條DNA鏈,，就有一個螢光分子形成，實現(xiàn)了螢光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步,。Real-time PCR的基本目標是精確測量和鑒別非常微量的特異性核酸,。

Real-time PCR鏈式反應(yīng)：每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不但操作煩瑣,，而且價格昂貴,，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發(fā)現(xiàn)對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義,，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷,、同時也降低了成本,，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床,。多重連接依賴探針擴增允許用單個引物對擴增多個靶標,，從而避免多重PCR的分辨率限制,。引物的設(shè)計注意事項：1，注意引物設(shè)計好后的產(chǎn)物長度,。Real-time PCR的較佳產(chǎn)物長度在150-250kb左右（書上說這樣可以增加熒光的敏感度,，減少實驗誤差，但是我對這個說法持懷疑態(tài)度,。產(chǎn)物長度越大,，SYBR嵌入的越多，這樣才能夠保證之后的熒光值比較可信）,。2,，不同的管家基因擴增效率不同。所以在做整個實驗之前應(yīng)該做一次檢測擴增效率的實驗,。如果擴增效率相差太大,，就不能使用delt，deltCt法來比較基因表達量的高低,。定量聚合酶鏈反應(yīng)或者實時聚合酶鏈反應(yīng)不要與逆轉(zhuǎn)錄允許估計樣品中存在的給定序列的量,。武漢組織數(shù)字PCR網(wǎng)站

實時定量PCR通用電腦，自動分析軟件等構(gòu)成,。蘇州骨頭Real-time PCR方案

Real-time PCR鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：反應(yīng)緩沖液未完全融化或未充分混勻,。確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻。引物特異性差,。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物,。引物量過多。減少反應(yīng)體系中引物的用量,。模板量過多,。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng,。外源DNA污染,。確保操作的潔凈。陰性對照出現(xiàn)條帶：試劑,，頭,，工作臺污染。使用全新的試劑和頭,，對工作臺進行清潔。條帶大小與理論不符：污染,。使用全新的試劑和頭,，對工作臺進行清潔。模板或引物使用錯誤,。更換引物和模板,?；騺喰汀ρ芯康幕蜻M行序列分析和BLAST研究,。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)較廣用于表達譜,，以確定基因的表達或鑒定RNA轉(zhuǎn)錄物的序列。蘇州骨頭Real-time PCR方案

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