引物的設(shè)計注意事項：1,，引物設(shè)計要跨內(nèi)含子,，不能在一個外顯子上（我們的實驗是以cDNA為模板來擴增的,，如果有DNA污染的話,，因為DNA上含有分子量很大的內(nèi)含子，不可能完成擴增,。這對我們消除整個實驗的誤差起很大的作用）,。2，引物設(shè)計的時候要盡可能設(shè)計在同一退火溫度,，方便于以后同時擴增很多不同的基因片段,。但是如果相差比較大，就得分開做,，浪費模板,，浪費管家基因，所以每個實驗室設(shè)計引物的時候要盡可能一致,，這樣就不用每次查退火溫度,，且對整個實驗有利。Real-time PCR探針法普遍用于人類傳染病的診斷和病原定量,。廣州組織熒光定量PCR網(wǎng)站

Real-time PCR-傳統(tǒng)定量PCR：1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記,，下游引物不標(biāo)記,。在模板擴增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴增,。在PCR產(chǎn)物中,，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同,，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度,，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板,。2）競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中,，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。廣州組織熒光定量PCR網(wǎng)站擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,。

Real-time PCR反應(yīng)：多重連接依賴探針擴增（MLPA):允許用單個引物對擴增多個靶標(biāo)，從而避免多重PCR的分辨率限制,。多重聚合酶鏈反應(yīng):由單個PCR混合物中的多個引物組組成,，以產(chǎn)生對不同DNA序列特異的不同大小的擴增子。通過同時靶向多個基因,，可以從單次測試中獲得額外的信息,，否則將需要幾次試劑和更多時間來執(zhí)行。每個引物組的退火溫度必須優(yōu)化,，以在單個反應(yīng)中正確工作,，并符合擴增子尺寸。也就是說,，當(dāng)通過凝膠電泳可視化時,，它們的堿基對長度應(yīng)該足夠不同以形成不同的條帶。

Real-time PCR式反應(yīng)準(zhǔn)備：10×擴增緩沖液,、4種dNTP混合物（終濃度）,、引物（終濃度）、模板DNA,、TaqDNA聚合酶,、Mg2+（終濃度）、補加雙蒸水等,。其中dNTP,、引物、模板DNA,、TaqDNA聚合酶以及Mg2+的加量（或濃度）可根據(jù)實驗調(diào)整,，以上表格只提供大致參考值。PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物(PCR引物為DN段,，細胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈）,、酶、dNTP,、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）,。引物有多種設(shè)計方法,，由PCR在實驗中的目的決定，但基本原則相同,。實時設(shè)備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進行正?；幚韥韽浹a背景熒光的差異。

Real-timePCR的反應(yīng)條件：dNTP濃度過高會加快反應(yīng)速度,，但同時還可以增加堿基的錯誤摻入率,。引物濃度過高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增。TaqDNA聚合酶濃度過高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增,，低則合成產(chǎn)物量減少,。TaqDNA聚合酶無校正功能，摻入錯誤率達2*E-4個核苷酸,，一個30個循環(huán)的擴增反應(yīng)0.1%-0.25%總錯誤率,。在90～95度下可使整個基因組的DNA變性為單鏈。一般94～95度30～60s,。時間過長使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多,。DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結(jié)合。引物長度在15～25時退火溫度,。在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。杭州細胞熒光定量PCR研究方案

聚合酶鏈反應(yīng)為這些技術(shù)提供了大量的純DNA,，有時是單鏈的,。廣州組織熒光定量PCR網(wǎng)站

引物的設(shè)計對于這個實驗至關(guān)重要，因為Real-time PCR的檢測靈敏度比較高,，所以相應(yīng)的對引物設(shè)計的要求就很高,。普通的要求規(guī)則大家都知道，還有幾點必須注意：1,，引物的錯配率（引物錯配形成引物二聚體,，但是SYBR照樣能嵌入進去，結(jié)果導(dǎo)致實驗結(jié)果的誤差很大,，重復(fù)性也不好）,。2，引物的特異性一定要高（不像常規(guī)PCR,，引物同源性不高,，只要兩條產(chǎn)物的片段長度相差足夠大，在電泳的時候能夠區(qū)分開就可以,。Real-time PCR只有在熔解曲線的時候能分開,，所以這就造成整個實驗結(jié)果誤差很大，不可信）。廣州組織熒光定量PCR網(wǎng)站

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