Real-time PCR的染料法和探針法的選擇：進行mRNA表達量的測定,，采用染料法是比較經(jīng)濟實惠的；染料法可以通過比較熔解曲線的熔解峰位置得到產(chǎn)物特異性的情況,；目的基因和內(nèi)參基因分管檢測,，染料法可以選用Realtime染料PCRPreMIX，探針法主要應用于病毒RNA的檢測,；以及單位點突變（SNP）,；多基因的合并檢測，探針法還可用于同一個反應中同時檢測目的基因和內(nèi)參基因的情況,；而染料法則必須分管檢測。Real-time PCR：實時熒光定量PCR技術（Real-timequantitativePolymeraseChainReaction簡稱Real-time PCR）是在定性PCR技術基礎上發(fā)展起來的核酸定量技術,。實時熒光定量在PCR反應體系中加入熒光基團,，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，使每一個循環(huán)變得“可見”,，之后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進行定量的方法,。聚合酶鏈式反應的模板的取材主要依據(jù)PCR的擴增對象。寧波骨頭定量PCR服務

Real-time PCR從用途上分可以分為定性分析和定量分析：定性分析指的是用于分析待檢測的樣本中是否存在我們想要檢測的成分,，即待檢測成分有無的分析,。通常，定性分析可以應用于病毒以及病原菌的檢測,，物種鑒定以及基因分型等,。病毒及病原菌檢測，如SARS,、H1N1病毒,，都可以通過Real-time PCR的方法進行高靈敏度的檢測，定性分析樣本是否已被病毒傳播,。物種鑒定如我們國家的一些檢驗檢疫機構,，想要檢測進口的牛肉制品中是否含有雞源、豬源或鴨源等成分,，或者用于檢測羊奶中是否會摻有牛奶等等,，可以通過Real-time PCR的方法進行檢測?；蚍中?，如啤酒型，肥胖型基因的檢測，就是Real-time PCR在基因分型方面的應用,。武漢微量RT-PCR檢測技術基于探針的化學法,，Real-time PCR應用一個或多個熒光標記的寡核苷酸探針檢測PCR擴增產(chǎn)物。

Real-time PCR從用途上分可以分為定性分析和定量分析：定量分析可以分為定量和相對定量兩種,。定量指的是我們想知道某個基因在初始樣品中具體的拷貝數(shù)或濃度是多少,？定量實驗必須使用已知拷貝數(shù)的標準品，必須做標準曲線,。而相對定量是指我們想知道某一個基因在不同樣品中表達量的差異,，其目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數(shù),。舉例來說,，如研究項目中包括使用高鹽脅迫處理的樣本和未高鹽脅迫處理的樣本，記為已處理樣本和未處理樣本,，通?？梢詫⑽刺幚順颖局付榛鶞剩?guī)定其目的基因濃度為100%,，用已處理樣本的定量結果除以未處理樣本的定量結果,，就可以計算每個已處理樣本的基因含量相對于未處理樣本的百分比。相對定量可以應用于差異顯示結果驗證,、基因芯片結果驗證,、siRNA效果確認、mRNA表達量分析等等,。

Real-time PCR操作流程：1,、收集樣品。2相關試劑總RNA提取試劑TREzolReagent(RNA提取試劑),M-MLV（cDNA逆轉錄酶）,RNA純化試劑,RealqPCRMasterMix（螢光定量PCR預混試劑）,。3實驗儀器螢光定量PCR儀;PCR儀,；低溫離心機。4總RNA提取,。5cDNA合成在0.5ml的離心管中加入1µl模板總RNA（1µg/µl）,；Real-time PCR操作流程：2µl隨機引物（T18,10pmol/ul）；2µl10mMdNTPmix,；加水至15µl體系,。混勻后70℃變性RNA5分鐘,，冰上速冷1分鐘,，離心將溶液收集至管底加入6µl5×PCRbuffer；1µlRNaseout,；1µlM-MLVRT,；加水至30µl體系,。PCR儀中反應條件設定37℃延伸60min，70℃保溫15min終止反應,。合成好的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆?。Real-time PCR技術即實時螢光定量PCR避免了傳統(tǒng)PCR以終產(chǎn)物監(jiān)測定量產(chǎn)生的偏差。

Real-time PCR鏈式反應的常見問題：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失,，影響引物與模板特異性結合,，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的,。假陽性：出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致,，有時其條帶更整齊，亮度更高,。引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列,。靶序列太短或引物太短,，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設計引物,。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶,。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高,，Mg2+濃度過高,，退火溫度過低,，循環(huán)次數(shù)過多引起,。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶,。②減少dNTP的濃度,。適當降低Mg2+濃度。增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù),。聚合酶鏈式反應準備：PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu，分別來自兩種不同的噬熱菌,。因為Real-time PCR的檢測靈敏度比較高,，所以相應的對引物設計的要求就很高。南京分子生物學定量PCR原理

Real-time PCR包括病原微生物或病毒含量的檢測,。寧波骨頭定量PCR服務

PCR的反應條件：dNTP濃度過高會加快反應速度,，但同時還可以增加堿基的錯誤摻入率。引物濃度過高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增,。TaqDNA聚合酶濃度過高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增,，低則合成產(chǎn)物量減少,。TaqDNA聚合酶無校正功能，摻入錯誤率達2*E-4個核苷酸,，一個30個循環(huán)的擴增反應0.1%-0.25%總錯誤率,。在90～95度下可使整個基因組的DNA變性為單鏈。一般94～95度30～60s,。時間過長使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多,。DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結合。引物長度在15～25時退火溫度,。熱啟動/冷完成聚合酶鏈反應是通過新的雜合聚合酶實現(xiàn)的,，這些酶在環(huán)境溫度下不活躍。寧波骨頭定量PCR服務

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