聚合酶鏈反應(yīng)注意事項(xiàng)：在實(shí)驗(yàn)過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性,。在總RNA的提取過程中,，注意避免mRNA的斷裂；為了防止非特異性擴(kuò)增,，必須設(shè)陰性對(duì)照；內(nèi)參的設(shè)定主要為了用于靶RNA的定量,。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）,、β-Actin（β-肌動(dòng)蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差,、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差,；PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期，出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長(zhǎng)度,、序列,、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對(duì)于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)的循環(huán)數(shù),，均應(yīng)通過單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來確定,；防止DNA的污染：采用DNA酶處理RNA；在可能的情況下,，將PCR引物置于基因的不同外顯子,，以消除基因和mRNA的共線性。聚合酶鏈反應(yīng)可以選擇這些突變來理解蛋白質(zhì)是如何完成其功能的,，并改變或改善蛋白質(zhì)功能,。基于探針的化學(xué)法,，Real-time PCR應(yīng)用一個(gè)或多個(gè)熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,。南京細(xì)胞PCR檢測(cè)技術(shù)方案

Real-time PCR探針法適用于：1,、具有高適應(yīng)性和可靠性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定重複性好,，特異性更高,。2、適用于擴(kuò)增序列專一的體系的檢測(cè),。3,、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測(cè)。4,、靶基因的特異序列較短,，無論怎樣較佳化引物設(shè)計(jì)條件都不能解決。5,、存在與靶基因同源的序列,，在PCR中容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，對(duì)特異性要求較高的定量,。6,、普遍用于人類傳染病的診斷和病原定量,在動(dòng)物病原體基因的檢測(cè),畜禽產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫,生物製品的鑒定。Real-time PCR探針法:PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的螢光探針,，該探針為一寡核苷酸,，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告螢光基團(tuán)和一個(gè)淬滅螢光基團(tuán)。探針完整時(shí),，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的螢光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收,；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,，使報(bào)告螢光基團(tuán)和淬滅螢光基團(tuán)分離,，從而螢光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到螢光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈,，就有一個(gè)螢光分子形成,，實(shí)現(xiàn)了螢光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。常州特殊樣本熒光定量PCR服務(wù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗(yàn)污染：PCR反應(yīng)的很大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性,，但令人腦袋不適的問題是易污染,，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生,。污染原因：標(biāo)本間交叉污染：標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí),，由于密封不嚴(yán)溢于容器外,，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染；標(biāo)本核酸模板在提取過程中,，由于吸樣污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染,；有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散,，導(dǎo)致彼此間的污染。PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中,，由于加樣,、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染,。如果基因的基因組DNA序列是已知的,，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)可以用來繪制基因中外顯子和內(nèi)含子的位置。

Real-timePCR技術(shù)服務(wù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗(yàn)污染：實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染：在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對(duì)照的檢驗(yàn)室,，這個(gè)問題也比較常見,。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒,，由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力。其污染可能性也很大,。污染的監(jiān)測(cè)：一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室,，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè)，考慮有無污染是什么原因造成的污染,，以便采取措施,，防止和消除污染。重復(fù)性試驗(yàn),。選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同,。

Real-time PCR：1.DNA或RNA的定量分析：Real-time PCR包括病原微生物或病毒含量的檢測(cè),轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測(cè),，RNAi基因失活率的檢測(cè)等；2.基因表達(dá)差異分析：例如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異(如藥物處理,、物理處理,、化學(xué)處理等)，特定基因在不同時(shí)相的表達(dá)差異以及cDNA晶片或差顯結(jié)果的確證,；3.基因分型：例如SNP檢測(cè),，甲基化檢測(cè)等。Real-time PCR常用的兩種方法分別為Sybrgreen（螢光染料摻入法）和Taqmanprobe（探針法）,。聚合酶鏈反應(yīng)允許快速生產(chǎn)短DN段,，即使已知的引物序列不超過兩個(gè)。常州特殊樣本熒光定量PCR服務(wù)

聚合酶鏈反應(yīng)的這種能力增強(qiáng)了許多方法,，例如生成雜交探針用于雜交,。南京細(xì)胞PCR檢測(cè)技術(shù)方案

Real-time PCR的染料法和探針法的選擇：進(jìn)行mRNA表達(dá)量的測(cè)定，采用染料法是比較經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的,；染料法可以通過比較熔解曲線的熔解峰位置得到產(chǎn)物特異性的情況,；目的基因和內(nèi)參基因分管檢測(cè),，染料法可以選用Realtime染料PCRPreMIX，探針法主要應(yīng)用于病毒RNA的檢測(cè),；以及單位點(diǎn)突變（SNP）,；多基因的合并檢測(cè)，探針法還可用于同一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)目的基因和內(nèi)參基因的情況,；而染料法則必須分管檢測(cè),。Real-time PCR：實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Real-timequantitativePolymeraseChainReaction簡(jiǎn)稱Real-time PCR）是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見”，之后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進(jìn)行定量的方法,。南京細(xì)胞PCR檢測(cè)技術(shù)方案