聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：10×擴增緩沖液、4種dNTP混合物（終濃度）,、引物（終濃度）,、模板DNA,、Taq DNA聚合酶,、Mg2+（終濃度）、補加雙蒸水等,。其中dNTP,、引物、模板DNA,、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或濃度）可根據(jù)實驗調(diào)整,，以上表格只提供大致參考值。PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物(PCR引物為DN段,，細胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈）,、酶、dNTP,、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）,。引物有多種設(shè)計方法,，由PCR在實驗中的目的決定，但基本原則相同,。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物,。徐州骨頭數(shù)字PCR方案

PCR的反應(yīng)條件：Tm=4（G+c）+（A+T）,，一般在45～55度,，溫度低容易退火但特異性低,；溫度高,，不容易退火但特異性高。退火時間30秒,。延伸溫度一般在70～75度這時TaqDNA聚合酶活性很高（150個/S）,，當(dāng)引物在16個堿基以下時可采用緩慢升高溫度到70～75度的方法,，使在低溫下就開始合成。一般<1KB時間1分鐘即可,。當(dāng)〈1KB時在較后的循環(huán)中延長擴增時間,。循環(huán)次數(shù)25～30次。無產(chǎn)物時：取10ul擴增混合液作模板在進行PCR擴增,；增加TaqDNA聚合酶濃度；增加循環(huán)次數(shù)；降低退火溫度,；加靶DNA量,。常州骨頭熒光定量PCR原理PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成,。

絕大多數(shù)聚合酶鏈反應(yīng)方法依賴于熱循環(huán)。熱循環(huán)將反應(yīng)物暴露于加熱和冷卻的重復(fù)循環(huán)中,，以允許不同的溫度依賴性反應(yīng)——具體地說,，脫氧核糖核酸融化和酶-驅(qū)動DNA復(fù)制,。聚合酶鏈反應(yīng)使用兩種主要試劑-引物(引物是短的單鏈DN段,，稱為寡核苷酸，是目標(biāo)DNA區(qū)域的互補序列)和DNA聚合酶,。在PCR反應(yīng)的步,，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩條鏈在高溫下物理分離,，這個過程稱為脫氧核糖核酸變性。第二步,，降低溫度,，引物與互補的脫氧核糖核酸序列結(jié)合。這兩條DNA鏈就變成了模板,，以酶促的方式從構(gòu)成DNA的自由核苷酸中組裝出一條新的DNA鏈,。隨著聚合酶鏈反應(yīng)的進行，產(chǎn)生的DNA本身被用作復(fù)制的模板,，啟動了一個連鎖反應(yīng),，原始的DNA模板是以指數(shù)形式放大,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗污染：實驗室中克隆質(zhì)粒的污染：在分子生物學(xué)實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見,。因為克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高,，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,，而且在活細胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力,。其污染可能性也很大,。污染的監(jiān)測：一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測,，考慮有無污染是什么原因造成的污染,，以便采取措施，防止和消除污染,。重復(fù)性試驗。選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增,。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)較廣用于表達譜，以確定基因的表達或鑒定RNA轉(zhuǎn)錄物的序列,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物,。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,，使之成為單鏈,，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備,；模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,，溫度降至55℃左右,，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合,；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下,，以dNTP為反應(yīng)原料,，靶序列為模板,，按堿基互補配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈,，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍,。聚合酶鏈反應(yīng)可以用于分析病癥,、微生物或其他疾病狀態(tài)中基因表達水平的變化,。武漢實時熒光PCR供應(yīng)商

序列間特異性聚合酶鏈反應(yīng)放大簡單重復(fù)序列之間的區(qū)域,，以產(chǎn)生擴增片段長度的獨特指紋,。徐州骨頭數(shù)字PCR方案

聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：MgCl2濃度過高,?？蛇m當(dāng)降低其用量。模板量過多,。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50 ng,，而基因組DNA則應(yīng)<200 ng。引物濃度不夠優(yōu)化,。對引物進行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng),。循環(huán)次數(shù)過多；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30,，縮短退火時間及延伸時間,，或改用二種溫度的PCR循環(huán)。退火溫度過低,。電泳體系有問題：凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大,；凝膠沒有凝固好；瓊脂糖質(zhì)量差,。若為PCR試劑盒則可能：由于運輸儲存不當(dāng)引起試劑盒失效,；試劑盒本身質(zhì)量有問題，如引物選擇,、循環(huán)參數(shù)等選擇不當(dāng),。降解的陳舊模板擴增也易產(chǎn)生涂布,。徐州骨頭數(shù)字PCR方案