聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性,。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔,，防止將靶序列吸入加樣內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒,。所用離心管及樣進(jìn)頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí),，在加標(biāo)本前,，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸,。二是空氣中的小片段核酸污染,，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性,?？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后,，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除,。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù),。南京實(shí)時(shí)Real-time PCR應(yīng)用

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗(yàn)污染：陽(yáng)性對(duì)照：在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽(yáng)性對(duì)照，它是PCR反應(yīng)是否成功,、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志,。陽(yáng)性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好,，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本,，如以重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，其含量宜低不宜高（100個(gè)拷貝以下）,。但陽(yáng)性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽(yáng)性標(biāo)本,，其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定,，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí),，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照：每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照,。它包括：標(biāo)本對(duì)照：被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對(duì)照,；被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照。試劑對(duì)照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染,。寧波微量Real-time PCR供應(yīng)商重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)：一種用于將兩個(gè)或多個(gè)含有互補(bǔ)序列的DN段拼接在一起的基因工程技術(shù)。

聚合酶鏈反應(yīng)允許快速生產(chǎn)短DN段,，即使已知的引物序列不超過兩個(gè),。聚合酶鏈反應(yīng)的這種能力增強(qiáng)了許多方法，例如生成雜交 探針用于 Southern 或northern blot 雜交,。聚合酶鏈反應(yīng)為這些技術(shù)提供了大量的純DNA,，有時(shí)是單鏈的，甚至可以從非常少量的起始材料中進(jìn)行分析,。脫氧核糖核酸測(cè)序的任務(wù)也可以通過聚合酶鏈反應(yīng)來輔助完成,。已知的DN段可以很容易地從患有遺傳疾病突變的患者體內(nèi)產(chǎn)生。對(duì)擴(kuò)增技術(shù)的修飾可以從完全未知的基因組中提取片段,，或者可以產(chǎn)生感興趣區(qū)域的單鏈,。聚合酶鏈反應(yīng)有許多應(yīng)用于傳統(tǒng)的 DNA克隆。它可以從更大的基因組中提取片段以插入載體,，這可能只有少量可用,。使用一組“載體引物”，它還可以分析或提取已經(jīng)插入載體的片段,。聚合酶鏈反應(yīng)方案的一些改變可以產(chǎn)生突變(通用的或定點(diǎn)的)插入片段,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性,，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶,。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul,、50ul,。或100ul,，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后,，再做大體積時(shí),，一定要模索條件，否則容易失敗,。物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要,，如變性溫度低，變性時(shí)間短,，極有可能出現(xiàn)假陰性,；退火溫度過低,，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì),，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性,、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一,。PCR的很大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種體外迅速擴(kuò)增DN段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模版,，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝,。DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下,，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),，DNA在高溫時(shí)由于兩條鏈之間的氫鍵被破壞也可以發(fā)生變性解鏈,，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)形成為雙鏈。因此,，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性,，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶,、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制,。但是，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活,，因此,，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不但操作煩瑣,，而且價(jià)格昂貴,，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義,，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷,、同時(shí)也降低了成本,，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床,。PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以內(nèi),，有些很好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。蘇州分子生物學(xué)熒光定量PCR設(shè)計(jì)公司

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑,。南京實(shí)時(shí)Real-time PCR應(yīng)用

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶,。非特異性條帶的出現(xiàn),，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體,。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān),。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶,。降低引物量,，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù),。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93℃變性,，65℃左右退火與延伸）。南京實(shí)時(shí)Real-time PCR應(yīng)用