聚合酶鏈式反應的特點：靈敏度高：PCR產物的生成量是以指數方式增加的,，能將皮克(pg=10-12）量級的起始待測模板擴增到微克（μg=-6）水平,。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞,；在病毒的檢測中,，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位）,；在細菌學中很小檢出率為3個細菌,。簡便,、快速：PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶,，一次性地將反應液加好后,，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應,，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析,，不一定要用同位素,，無放射性污染、易推廣,。純度要求低：不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞,，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液,、體腔液、洗嗽液,、毛發(fā),、細胞、活組織等DNA擴增檢測,。聚合酶鏈式反應：模板的制備,，PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA,。上海實時定量PCR技術服務

聚合酶鏈式反應：定量PCR允許實時定量和檢測特定的DNA序列,，因為它在合成過程中測量濃度。有兩種方法可以同時檢測和定量,。種方法是使用在DNA雙鏈之間非特異性保留的熒光染料,。第二種方法涉及編碼特定序列并被熒光標記的探針。只有在探針與其互補DNA雜交后,，才能使用這些方法檢測DNA,。一種有趣的技術組合是實時PCR和逆轉錄。這種復雜的技術被稱為RT-qPCR,，允許定量少量RNA。通過這種組合技術,，mRNA被轉化為cDNA,，并用qPCR進一步定量。這種技術降低了聚合酶鏈反應終點出錯的可能性,，增加了檢測與遺傳疾病如病癥相關的基因的機會,。實驗室使用RT-qPCR來靈敏地測量基因調控。徐州血液熒光PCR原理及步驟聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用于放大擴增特定的DN段的分子生物學技術。

聚合酶鏈反應的常見問題分析與解決方法：MgCl2濃度過高,?？蛇m當降低其用量。模板量過多,。質粒DNA的用量應<50 ng,，而基因組DNA則應<200 ng。引物濃度不夠優(yōu)化,。對引物進行梯度稀釋重復PCR反應,。循環(huán)次數過多；增加模板量減少循環(huán)次數至30,，縮短退火時間及延伸時間,，或改用二種溫度的PCR循環(huán)。退火溫度過低,。電泳體系有問題：凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大,；凝膠沒有凝固好；瓊脂糖質量差,。若為PCR試劑盒則可能：由于運輸儲存不當引起試劑盒失效,；試劑盒本身質量有問題，如引物選擇,、循環(huán)參數等選擇不當,。降解的陳舊模板擴增也易產生涂布。

聚合酶鏈式反應是一種體外迅速擴增DN段的技術,，它能以極少量的DNA為模版,，在幾小時內復制出上百萬份的DNA拷貝。DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑,。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝,。在實驗中發(fā)現,，DNA在高溫時由于兩條鏈之間的氫鍵被破壞也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復形成為雙鏈,。因此,，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，并設計引物做啟動子,，加入DNA聚合酶,、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。但是,，DNA聚合酶在高溫時會失活,，因此,，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不但操作煩瑣,，而且價格昂貴,，制約了PCR技術的應用和發(fā)展。發(fā)現耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義,，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術變得非常簡捷,、同時也降低了成本,，PCR技術得以大量應用，并逐步應用于臨床,。PCR產物的電泳檢測時間一般為48h以內,，有些很好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失,。

現在有些PCR因為擴增區(qū)很短,，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法,，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行,，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度,。檢測：PCR反應擴增出了高的拷貝數,，下一步檢測就成了關鍵。熒光素（溴化乙錠,，EB）染色凝膠電泳是很常用的檢測手段,。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判,。但因為其簡捷易行,，成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為的檢測方法,，有逐漸取代電泳法的趨勢,。聚合酶鏈式反應中兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊,。南京實時熒光PCR原理及步驟

許多疾病的未知病因的測序正在通過聚合酶鏈反應得到解決,。上海實時定量PCR技術服務

聚合酶鏈反應注意事項：在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性,。在總RNA的提取過程中,，注意避免mRNA的斷裂；為了防止非特異性擴增,，必須設陰性對照,；內參的設定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）,、β-Actin（β-肌動蛋白）等,。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差,；PCR不能進入平臺期,，出現平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列,、二級結構以及目標DNA起始的數量有關,。故對于每一個目標序列出現平臺效應的循環(huán)數，均應通過單獨實驗來確定,；防止DNA的污染： 采用DNA酶處理RNA,； 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子,，以消除基因和mRNA的共線性,。上海實時定量PCR技術服務