聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：反應(yīng)緩沖液未完全融化或未充分混勻,。確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻,。引物特異性差,。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物,。引物量過多。減少反應(yīng)體系中引物的用量,。模板量過多,。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng,，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。外源DNA污染,。確保操作的潔凈,。陰性對照出現(xiàn)條帶：試劑，頭,，工作臺污染,。使用全新的試劑和頭，對工作臺進行清潔,。條帶大小與理論不符：污染,。使用全新的試劑和頭，對工作臺進行清潔,。模板或引物使用錯誤。更換引物和模板,?；騺喰汀ρ芯康幕蜻M行序列分析和BLAST研究,。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板的取材主要依據(jù)PCR的擴增對象,，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細菌,、菌類等,。莆田實時RT-PCR檢測技術(shù)哪家好

industryTemplate莆田血液熒光PCR原理及步驟PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克量級的起始待測模板擴增到微克水平,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種體外迅速擴增DN段的技術(shù),，它能以極少量的DNA為模版，在幾小時內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝,。DNA的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑,。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下,，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝,。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時由于兩條鏈之間的氫鍵被破壞也可以發(fā)生變性解鏈,，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)形成為雙鏈,。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性,，并設(shè)計引物做啟動子,，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制,。但是,，DNA聚合酶在高溫時會失活,，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,，不但操作煩瑣,，而且價格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展,。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義,，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶,，使PCR技術(shù)變得非常簡捷,、同時也降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用,，并逐步應(yīng)用于臨床,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：Taq(水生棲熱菌)聚合酶耐熱DNA聚合酶的很好活性溫度約為75-80°C(167-176°F),盡管該酶通常使用72°C(162°F)的溫度。在該步驟中,，DNA聚合酶通過從反應(yīng)混合物中添加在5’-至-3’方向上與模板互補的游離DNA鏈來合成與DNA模板鏈互補的新DNA鏈,，在新生(伸長)DNA鏈的末端，將dNTPs的5'-磷酸基與3'-羥基縮合,。延伸所需的精確時間取決于所使用的DNA聚合酶和要擴增的DNA目標(biāo)區(qū)域的長度,。根據(jù)經(jīng)驗，在很好溫度下,，大多數(shù)DNA聚合酶每分鐘聚合一千個堿基,。在很好條件下(即，如果沒有限制底物或試劑的限制),，在每個延伸/延伸步驟中,，DNA靶序列的數(shù)量加倍。隨著每一個連續(xù)的循環(huán),，原始模板鏈加上所有新產(chǎn)生的鏈成為下一輪延伸的模板鏈,，導(dǎo)致特定DNA目標(biāo)區(qū)域的指數(shù)(幾何)擴增。嵌套式PCR在特異性擴增長DN段方面通常比傳統(tǒng)PCR更成功,，但它需要更詳細的目標(biāo)序列知識,。

聚合酶鏈反應(yīng)有許多優(yōu)點。它很容易理解和使用,，并迅速產(chǎn)生結(jié)果,。這項技術(shù)非常敏感，有可能產(chǎn)生數(shù)百萬到數(shù)十億份特定產(chǎn)品的拷貝,，用于測序,、克隆和分析。qRT-PCR具有與PCR相同的優(yōu)點,，同時還具有定量合成產(chǎn)物的優(yōu)點,。因此,，它可以用于分析病癥、微生物或其他疾病狀態(tài)中基因表達水平的變化,。聚合酶鏈反應(yīng)是一種非常強大和實用的研究工具,。許多疾病的未知病因的測序正在通過聚合酶鏈反應(yīng)得到解決。這項技術(shù)可以幫助我們識別與已知病毒相關(guān)的未知病毒序列,，從而讓我們更好地了解疾病本身,。如果該過程可以進一步簡化，并且可以開發(fā)靈敏的非輻射檢測系統(tǒng),，PCR將在未來幾年在臨床實驗室中占據(jù)明顯地位,。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。無錫組織熒光PCR原理及步驟

PCR的另一個限制是,，即使是很少量的污染DNA也可以被擴增,，導(dǎo)致誤導(dǎo)或模糊的結(jié)果。莆田實時RT-PCR檢測技術(shù)哪家好

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：出現(xiàn)非特異性擴增帶：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致,，或大或小,，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體,。二是Mg2+離子濃度過高,、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān),。其次是酶的質(zhì)和量,，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增,。其對策有：必要時重新設(shè)計引 物,。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量,，適當(dāng)增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性,，65℃左右退火與延伸）,。莆田實時RT-PCR檢測技術(shù)哪家好