聚合酶鏈式反應又稱多聚酶鏈式反應,，是一項利用DNA雙鏈復制的原理，在生物體外復制特定DN段的核酸合成技術。透過這項技術,，可在短時間內(nèi)大量擴增目的基因,，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體,。聚合酶鏈反應是是一種簡單,，廉價和可靠的方法復制DN段，這個概念適用于現(xiàn)物學和相關科學的許多領域,。 PCR可能是分子生物學中使用很較廣的技術,。這種技術被用于生物醫(yī)學研究，犯罪取證和分子考古學,。通常,，PCR由一系列20-40次重復的溫度變化組成，稱為熱循環(huán),，每個循環(huán)通常由兩個或三個離散的溫度步驟組成,。多重連接依賴探針擴增允許用單個引物對擴增多個靶標，從而避免多重PCR的分辨率限制,。南京分子生物學Real-time PCR方案

聚合酶鏈式反應：DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈,，在DNA聚合酶的參與下,，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈,，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈,。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性,，加入設計引物,，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制,。但是,，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此,，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不但操作煩瑣,，而且價格昂貴,，制約了PCR技術的應用和發(fā)展。耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發(fā)現(xiàn)對于PCR的應用有里程碑的意義,，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術變得非常簡捷,、同時也降低了成本,，PCR技術得以大量應用，并逐步應用于臨床,。上海微量熒光定量PCR供應商聚合酶鏈式反應中要確保反應緩沖液融化完全并徹底混勻,。

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聚合酶鏈反應的常見問題分析與解決方法：無擴增條帶：酶失活或在反應體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運輸不當而失活,，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結果,。模板含有雜質(zhì)。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸,，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結果,。變性溫度是否準確：PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符,，過高酶在前幾個循環(huán)就迅速失活,；過低則模板變性不徹底。反應系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶,，應在未加Taq酶以前,，將反應體系95℃加熱5-10 min。引物變質(zhì)失效,。人工合成的引物是否正確,。是否純化,，或因儲存條件不當而失活。引物錯誤,。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物,。 DNA凝膠電泳時加入陽性對照，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題,。在嵌套聚合酶鏈反應中,，除了預期的靶之外，該產(chǎn)物可能仍然由非特異性擴增的DN段組成,。

絕大多數(shù)聚合酶鏈反應方法依賴于熱循環(huán),。熱循環(huán)將反應物暴露于加熱和冷卻的重復循環(huán)中，以允許不同的溫度依賴性反應——具體地說,，脫氧核糖核酸融化和酶-驅動DNA復制,。聚合酶鏈反應使用兩種主要試劑-引物(引物是短的單鏈DN段，稱為寡核苷酸,，是目標DNA區(qū)域的互補序列)和DNA聚合酶,。在PCR反應的步，DNA雙螺旋結構的兩條鏈在高溫下物理分離,，這個過程稱為脫氧核糖核酸變性,。第二步，降低溫度,，引物與互補的脫氧核糖核酸序列結合,。這兩條DNA鏈就變成了模板，以酶促的方式從構成DNA的自由核苷酸中組裝出一條新的DNA鏈,。隨著聚合酶鏈反應的進行,，產(chǎn)生的DNA本身被用作復制的模板，啟動了一個連鎖反應,，原始的DNA模板是以指數(shù)形式放大,。PCR的另一個限制是，即使是很少量的污染DNA也可以被擴增,，導致誤導或模糊的結果,。南京分子生物學Real-time PCR方案

為了很大限度地減少污染的可能性，調(diào)查人員應該為試劑制備,、聚合酶鏈反應和產(chǎn)品分析預留單獨的房間,。南京分子生物學Real-time PCR方案

PCR的反應條件：dNTP濃度過高會加快反應速度，但同時還可以增加堿基的錯誤摻入率,。引物濃度過高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增,。TaqDNA聚合酶濃度過高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增，低則合成產(chǎn)物量減少,。TaqDNA聚合酶無校正功能,，摻入錯誤率達2*E-4個核苷酸,，一個30個循環(huán)的擴增反應0.1%-0.25%總錯誤率。在90～95度下可使整個基因組的DNA變性為單鏈,。一般94～95度30～60s。時間過長使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多,。DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結合,。引物長度在15～25時退火溫度。南京分子生物學Real-time PCR方案