聚合酶鏈反應(yīng)：多重連接依賴探針擴(kuò)增（MLPA):允許用單個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo),，從而避免多重PCR的分辨率限制,。多重聚合酶鏈反應(yīng):由單個(gè)PCR混合物中的多個(gè)引物組組成，以產(chǎn)生對(duì)不同DNA序列特異的不同大小的擴(kuò)增子,。通過(guò)同時(shí)靶向多個(gè)基因,，可以從單次測(cè)試中獲得額外的信息，否則將需要幾次試劑和更多時(shí)間來(lái)執(zhí)行,。每個(gè)引物組的退火溫度必須優(yōu)化,，以在單個(gè)反應(yīng)中正確工作，并符合擴(kuò)增子尺寸,。也就是說(shuō),，當(dāng)通過(guò)凝膠電泳可視化時(shí),，它們的堿基對(duì)長(zhǎng)度應(yīng)該足夠不同以形成不同的條帶。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的DMSO,、甘油等,，主要用來(lái)保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)。徐州骨頭定量PCR網(wǎng)站

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失,，影響引物與模板特異性結(jié)合,，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的,。假陽(yáng)性：出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高,。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列,。靶序列太短或引物太短,，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物,。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶,。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過(guò)高,，Mg2+濃度過(guò)高,，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起,。其對(duì)策有：減少酶量,，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。②減少dNTP的濃度,。適當(dāng)降低Mg2+濃 度,。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù),。無(wú)錫骨頭PCR檢測(cè)技術(shù)網(wǎng)站逆轉(zhuǎn)錄酶將核糖核酸逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ,，然后通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗(yàn)污染：實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染：在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照的檢驗(yàn)室,，這個(gè)問(wèn)題也比較常見(jiàn),。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過(guò)程中需用較多的用具及試劑,，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒,，由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力。其污染可能性也很大,。污染的監(jiān)測(cè)：一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室,，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè),，考慮有無(wú)污染是什么原因造成的污染，以便采取措施,，防止和消除污染,。重復(fù)性試驗(yàn)。選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,。

聚合酶鏈反應(yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題分析與解決方法：PCR產(chǎn)物量過(guò)少：退火溫度不合適,。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。DNA模板量太少,。增加DNA模板量,。PCR循環(huán)數(shù)不足。增加反應(yīng)循環(huán)數(shù),。引物量不足,。增加體系中引物含量。延伸時(shí)間太短,。以1 kb/min的原則設(shè)置延伸時(shí)間,。變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致DNA聚合酶失活,。DNA模板中存在抑制劑,。確保DNA模板干凈。擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散：酶量過(guò)高,。減少酶量,；酶的質(zhì)量差，調(diào)換另一來(lái)源的酶,。dNTP濃度過(guò)高,。減少dNTP的濃度。電子聚合酶鏈反應(yīng)用于計(jì)算理論聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特點(diǎn)：靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,，能將皮克(pg=10-12）量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克（μg=-6）水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞,；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位）,；在細(xì)菌學(xué)中很小檢出率為3個(gè)細(xì)菌,。簡(jiǎn)便、快速：PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶,，一次性地將反應(yīng)液加好后,，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng),。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析,，不一定要用同位素,，無(wú)放射性污染、易推廣,。純度要求低：不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞,，DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液,、體腔液、洗嗽液,、毛發(fā),、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè),。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng))：用于從RNA中擴(kuò)增DNA,。南京實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)原理及步驟

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中要確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻。徐州骨頭定量PCR網(wǎng)站

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗(yàn)污染：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染：這是PCR反應(yīng)中很主要很常見(jiàn)的污染問(wèn)題,。因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大（一般為1013拷貝/ml）,，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染,，就可形成假陽(yáng)性,。還有一種容易忽視，很可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染,。在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開(kāi)蓋時(shí),、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染,。據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆粒可含48000拷貝,，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問(wèn)題,。徐州骨頭定量PCR網(wǎng)站