聚合酶鏈式反應的常見問題：陰性：需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質量,、引物的濃度,、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想,、容易彌散的常見原因,。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高,，一條濃度低,，造成低效率的不對稱擴增，對策為：選定一個好的引物合成單位,。引物的濃度不但要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,，一定要有引物條帶出現(xiàn),，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶,，一條引物無條帶,，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決,。如一條引物亮度高,，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度,。引物應高濃度小量分裝保存,，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效,。引物設計不合理,，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等,。聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用于放大擴增特定的DN段的分子生物學技術,。南通微量RT-PCR檢測技術服務

聚合酶鏈式反應：模板的制備，PCR的模板可以是DNA,，也可以是RNA,。模板的取材主要依據(jù)PCR的擴增對象,，可以是病原體標本如病毒、細菌,、菌類等,。也可以是病理生理標本如細胞、血液,、羊水細胞等,。法醫(yī)學標本有血斑、精斑,、毛發(fā)等,。標本處理的基本要求是除去雜質，并部分純化標本中的核酸,。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理,。難以破碎的細菌，可用溶菌酶加EDTA處理,。所得到的粗制DNA,，經(jīng)酚、氯仿抽提純化,，再用乙醇沉淀后用作PCR反應模板,。南通微量RT-PCR檢測技術服務聚合酶鏈反應很容易理解和使用，并迅速產(chǎn)生結果,。

聚合酶鏈式反應的常見問題：靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染,，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔,，防止將靶序列吸入加樣內或濺出離心管外,。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒,。所用離心管及樣進頭等均應一次性使用,。必要時，在加標本前,，反應管和試劑用紫外線照射,，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,，這些小片段比靶序列短,，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物,，而導致假陽性的產(chǎn)生,，可用巢式PCR方法來減輕或消除,。

聚合酶鏈式反應準備：10×擴增緩沖液、4種dNTP混合物（終濃度）,、引物（終濃度）,、模板DNA、Taq DNA聚合酶,、Mg2+（終濃度）,、補加雙蒸水等。其中dNTP,、引物,、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或濃度）可根據(jù)實驗調整,，以上表格只提供大致參考值,。PCR反應五要素：參加PCR反應的物質主要有五種即：引物(PCR引物為DN段，細胞內DNA復制的引物為一段RNA鏈）,、酶,、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）,。引物有多種設計方法,，由PCR在實驗中的目的決定，但基本原則相同,。電子聚合酶鏈反應用于計算理論聚合酶鏈反應結果,。

聚合酶鏈反應注意事項：在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性,。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂,；為了防止非特異性擴增,，必須設陰性對照；內參的設定：主要為了用于靶RNA的定量,。常用的內參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）,、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差,、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差,；PCR不能進入平臺期，出現(xiàn)平臺效應與所擴增的目的基因的長度,、序列,、二級結構以及目標DNA起始的數(shù)量有關。故對于每一個目標序列出現(xiàn)平臺效應的循環(huán)數(shù),，均應通過單獨實驗來確定,；防止DNA的污染： 采用DNA酶處理RNA,； 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子,，以消除基因和mRNA的共線性,。嵌套聚合酶鏈反應的兩組引物用于兩個連續(xù)的PCR。南通微量RT-PCR檢測技術服務

聚合酶鏈反應具有定量合成產(chǎn)物的優(yōu)點,。南通微量RT-PCR檢測技術服務

聚合酶鏈反應允許快速生產(chǎn)短DN段,，即使已知的引物序列不超過兩個。聚合酶鏈反應的這種能力增強了許多方法,，例如生成雜交 探針用于 Southern 或northern blot 雜交,。聚合酶鏈反應為這些技術提供了大量的純DNA，有時是單鏈的,，甚至可以從非常少量的起始材料中進行分析,。脫氧核糖核酸測序的任務也可以通過聚合酶鏈反應來輔助完成。已知的DN段可以很容易地從患有遺傳疾病突變的患者體內產(chǎn)生,。對擴增技術的修飾可以從完全未知的基因組中提取片段,，或者可以產(chǎn)生感興趣區(qū)域的單鏈。聚合酶鏈反應有許多應用于傳統(tǒng)的 DNA克隆,。它可以從更大的基因組中提取片段以插入載體,，這可能只有少量可用。使用一組“載體引物”,，它還可以分析或提取已經(jīng)插入載體的片段,。聚合酶鏈反應方案的一些改變可以產(chǎn)生突變(通用的或定點的)插入片段。南通微量RT-PCR檢測技術服務