一代、二代,、三代測(cè)序的區(qū)別分別是什么,？

一代測(cè)序是上世紀(jì)70年代由Sanger和Coulson開創(chuàng)的DNA雙脫氧鏈終止法測(cè)序，也稱為Sanger測(cè)序,。

二代測(cè)序技術(shù)(NGS)是為了改進(jìn)一代測(cè)序通量過低的問題而出現(xiàn)的,，能夠同時(shí)對(duì)上百萬甚至數(shù)十億個(gè)DNA分子進(jìn)行測(cè)序?qū)崿F(xiàn)了大規(guī)模、高通量測(cè)序的目標(biāo),。

三代測(cè)序主要有兩種技術(shù)PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore 的納米孔單分子測(cè)序技術(shù),，這兩種技術(shù)的測(cè)序讀長都可以達(dá)到幾-kb的級(jí)別，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于二代測(cè)序技術(shù),。 基因組重測(cè)序是二代測(cè)序嗎,？北京嘉安健達(dá)二代測(cè)序原理

二代測(cè)序——轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的實(shí)驗(yàn)流程（上）

樣本采集和 RNA 提取

樣本采集需要考慮研究目的和樣本類型。例如,，研究**組織的轉(zhuǎn)錄組,，就要準(zhǔn)確獲取**組織樣本，同時(shí)比較好有對(duì)應(yīng)的正常組織作為對(duì)照,。RNA 提取方法有多種,，常用的如 Trizol 法,，它可以有效地從細(xì)胞或組織中提取總 RNA，包括 mRNA,、rRNA 和 tRNA 等,。提取后的 RNA 質(zhì)量至關(guān)重要，需要通過瓊脂糖凝膠電泳或?qū)ｉT的 RNA 質(zhì)量檢測(cè)儀器來評(píng)估 RNA 的完整性和純度,。

RNA 質(zhì)量檢測(cè)和定量

完整性方面,，通常使用 RNA 完整性指數(shù)（RIN）來衡量。RIN 值越高（一般認(rèn)為 RIN > 7 是高質(zhì)量 RNA）,，說明 RNA 完整性越好,。定量方法主要有紫外分光光度法和熒光定量法。紫外分光光度法可以通過測(cè)量 RNA 在 260nm 和 280nm 處的吸光度比值來估計(jì) RNA 純度,，比值在 1.8 - 2.0 之間表示純度較好,。熒光定量法則是使用專門的熒光染料（如 Qubit）來更準(zhǔn)確地測(cè)量 RNA 濃度。

文庫構(gòu)建

首先要進(jìn)行mRNA富集,，一般使用帶有poly-T的磁珠來特異性地捕獲mRNA,，因?yàn)檎婧松飉RNA的3'端都有poly-A尾巴。然后將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,，再通過超聲或酶切等方法將cDNA片段化,，片段大小通常在幾百個(gè)堿基對(duì)左右。之后在片段兩端連接上測(cè)序接頭,，經(jīng)過PCR擴(kuò)增來增加文庫的量,，使其達(dá)到可以上機(jī)測(cè)序的要求。

重慶嘉安健達(dá)二代測(cè)序流程二代測(cè)序即高通量測(cè)序技術(shù),。

二代測(cè)序—全外顯子測(cè)序的應(yīng)用領(lǐng)域

醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：1,、疾病診斷：用于診斷各種遺傳性疾病，包括單基因遺傳?。ㄈ缒倚岳w維化,、杜氏肌營養(yǎng)不良等）和復(fù)雜疾病（如**,、心血管疾病等）,。在**研究中，通過對(duì)**組織和正常組織進(jìn)行全外顯子測(cè)序,，可以發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中的體細(xì)胞突變,，這些突變可能是導(dǎo)致**發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素,，有助于醫(yī)生制定個(gè)性化的治療方案。2,、藥物研發(fā)：幫助研究人員了解藥物靶點(diǎn)的基因變異情況,。例如，如果發(fā)現(xiàn)某些患者的藥物靶點(diǎn)基因外顯子區(qū)域存在突變，可能會(huì)影響藥物的療效,，從而可以針對(duì)性地開發(fā)新的藥物或者調(diào)整藥物的使用劑量和方式,。

遺傳學(xué)研究：用于研究人類群體的遺傳多樣性，通過對(duì)不同人群的外顯子測(cè)序,，可以發(fā)現(xiàn)不同人群之間的基因差異,，這些差異可能與人群的適應(yīng)性、易感性等有關(guān),。還可以用于追蹤基因的進(jìn)化歷程,，了解基因在進(jìn)化過程中的變化情況。

二代測(cè)序的建庫步驟④

四,、接頭連接

接頭選擇：根據(jù)測(cè)序平臺(tái)的要求選擇合適的接頭,。不同的二代測(cè)序平臺(tái)（如Illumina、IonTorrent等）有各自特定設(shè)計(jì)的接頭,。這些接頭包含與測(cè)序平臺(tái)的流動(dòng)池（flowcell）表面互補(bǔ)的序列,，用于將DNA片段固定在測(cè)序芯片上，還包含用于區(qū)分不同樣本的索引序列（index）等,。

連接反應(yīng)：使用DNA連接酶將接頭與DNA片段連接,。T4DNA連接酶是常用的連接酶，它可以在ATP（三磷酸腺苷）存在下,，將接頭的5'-磷酸基團(tuán)與DNA片段的3'-羥基形成磷酸二酯鍵,，從而將接頭連接到DNA片段的兩端。連接反應(yīng)的條件（如溫度,、連接酶的用量,、反應(yīng)時(shí)間等）需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化，以確保較高的連接效率,。 單細(xì)胞測(cè)序也是二代測(cè)序,。

二代測(cè)序技術(shù)的一些***研究進(jìn)展①

疾病診斷與***領(lǐng)域 ：消化系統(tǒng)**標(biāo)志物檢測(cè)：2024 年的**共識(shí)指出，二代測(cè)序（NGS）技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)消化系統(tǒng)**中的多種標(biāo)志物,，如錯(cuò)配修復(fù)基因變異,、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）狀態(tài)、**突變負(fù)荷（TMB）等,，為**的精細(xì)***提供了更***,、準(zhǔn)確的信息。例如,，MSI-H 的實(shí)體瘤患者可使用帕博利珠單抗進(jìn)行***,，而 NGS 技術(shù)能更好地檢測(cè) MSI 狀態(tài)及相關(guān)耐藥機(jī)制。

**液體活檢：通過檢測(cè)血液中的循環(huán)** DNA（ctDNA）等標(biāo)志物,，實(shí)現(xiàn)對(duì)**的早期篩查,、診斷和***監(jiān)測(cè),。NGS 技術(shù)能夠更敏感地檢測(cè)到 ctDNA 中的基因突變和變異，為**的無創(chuàng)診斷提供了有力支持,。

二代測(cè)序的優(yōu)勢(shì)是高靈敏度,。河南嘉安健達(dá)二代測(cè)序分析

二代測(cè)序是2005年以后開始的嗎？北京嘉安健達(dá)二代測(cè)序原理

宏基因組二代測(cè)序,，你了解多少,？

宏基因組二代測(cè)序（mNGS）是一項(xiàng)覆蓋病原譜廣且高通量的檢測(cè)技術(shù)，已在臨床領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用,。對(duì)于血液病患者,，病原mNGS通過對(duì)樣本快速高通量測(cè)序，可以獲得更準(zhǔn)確,、相對(duì)無偏倚的病原信息,，對(duì)病原診斷起到積極的作用，尤其對(duì)傳統(tǒng)微生物學(xué)檢測(cè)未覆蓋到或檢測(cè)周期較長,、陽性率較低的病原可提高檢出率,。對(duì)于臨床相關(guān)樣本應(yīng)首先完善傳統(tǒng)微生物學(xué)檢測(cè)，病理,、無菌標(biāo)本培養(yǎng)仍然是診斷的金標(biāo)準(zhǔn),，病原mNGS是對(duì)傳統(tǒng)微生物學(xué)檢測(cè)的有力補(bǔ)充和延展而非替代。病原mNGS的報(bào)告解讀應(yīng)充分評(píng)估檢出微生物的致病性,、流行病學(xué),、生物信息學(xué)信息，同時(shí)在結(jié)合患者臨床特征的基礎(chǔ)上進(jìn)行綜合判斷,。 北京嘉安健達(dá)二代測(cè)序原理