二代測(cè)序——質(zhì)量控制類問(wèn)題

如何評(píng)估二代測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量：主要通過(guò)一些質(zhì)量指標(biāo)來(lái)評(píng)估,，如Q值（質(zhì)量值）分布，用于衡量每個(gè)堿基的測(cè)序質(zhì)量；堿基含量分布，檢查四種堿基的比例是否正常,；GC含量分布，看是否與預(yù)期的基因組GC含量相符,；序列重復(fù)度,，評(píng)估數(shù)據(jù)中重復(fù)序列的比例；比對(duì)率,，即測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)上的比例等,。影響二代測(cè)序質(zhì)量的因素有哪些：樣本質(zhì)量是關(guān)鍵因素之一,，如DNA的純度、完整性和濃度等會(huì)影響文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序結(jié)果,；文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中的操作不當(dāng),，如片段化過(guò)度、接頭連接效率低等,；測(cè)序儀器的性能和運(yùn)行狀態(tài),，包括試劑的質(zhì)量、測(cè)序芯片的質(zhì)量,、儀器的校準(zhǔn)等,；生物信息學(xué)分析過(guò)程中的參數(shù)設(shè)置和算法選擇也會(huì)對(duì)**終的結(jié)果質(zhì)量產(chǎn)生影響。 單細(xì)胞測(cè)序?qū)儆诙鷾y(cè)序嗎,？海南嘉安健達(dá)二代測(cè)序分析

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的主要測(cè)序?qū)ο蟀ㄒ韵聨最悾ㄉ希?

信使RNA（mRNA）

mRNA是編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本,，在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中，可通過(guò)對(duì)mRNA的測(cè)序和分析,，了解基因的表達(dá)水平,、可變剪接情況以及基因結(jié)構(gòu)變異等，從而揭示基因在特定細(xì)胞或組織中的功能和調(diào)控機(jī)制,。

非編碼RNA

核糖體RNA（rRNA）：雖然rRNA在細(xì)胞中的含量豐富,，但在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中，通常會(huì)在前期實(shí)驗(yàn)中通過(guò)特定的方法將其去除,，以減少其對(duì)其他RNA測(cè)序的干擾,。不過(guò)在某些特殊研究中，如對(duì)rRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制或其與其他分子的相互作用研究時(shí),，也可能會(huì)專門(mén)針對(duì)rRNA進(jìn)行測(cè)序,。

轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）：tRNA在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中起著重要的轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的作用。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以對(duì)tRNA的轉(zhuǎn)錄水平,、修飾情況以及與其他RNA或蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行研究,，以深入了解其在基因表達(dá)調(diào)控中的功能。

微小 RNA（miRNA）：miRNA 是一類長(zhǎng)度較短的非編碼 RNA,，通常通過(guò)與 mRNA 的互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合,，抑制 mRNA 的翻譯或促使其降解，從而調(diào)控基因表達(dá),。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以發(fā)現(xiàn)新的 miRNA,，研究其在不同生理和病理狀態(tài)下的表達(dá)變化以及作用靶點(diǎn)等。 海南哪里有二代測(cè)序應(yīng)用二代測(cè)序包括全基因組測(cè)序和全外顯子測(cè)序,。

二代測(cè)序用于蛋白組測(cè)序的優(yōu)勢(shì)

高通量：二代測(cè)序本身具有一次性處理大量核酸序列的能力,，在結(jié)合蛋白組測(cè)序相關(guān)應(yīng)用時(shí)，能快速獲取大規(guī)模的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),，進(jìn)而可以對(duì)眾多潛在的蛋白質(zhì)信息進(jìn)行分析推斷,，相比傳統(tǒng)逐個(gè)蛋白分析的方法,，**提高了效率，能夠在短時(shí)間內(nèi)覆蓋更***的蛋白組范圍,。

能發(fā)現(xiàn)新蛋白及異構(gòu)體：借助對(duì)轉(zhuǎn)錄組的深度測(cè)序，可以挖掘出一些新的轉(zhuǎn)錄本,，這些轉(zhuǎn)錄本有可能翻譯出全新的蛋白質(zhì)或者產(chǎn)生蛋白質(zhì)異構(gòu)體,，有助于拓展對(duì)蛋白組復(fù)雜程度的認(rèn)知，發(fā)現(xiàn)那些以往可能被遺漏的蛋白質(zhì)種類和形式,。

二代測(cè)序—全外顯子測(cè)序的原理是什么,？全外顯子測(cè)序主要是利用序列捕獲技術(shù)，將基因組DNA中的外顯子區(qū)域富集起來(lái),，然后通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)（如第二代測(cè)序技術(shù)Illumina測(cè)序平臺(tái)）對(duì)富集后的外顯子DN**段進(jìn)行測(cè)序,。其大致步驟包括DNA提取、片段化,、文庫(kù)構(gòu)建,、外顯子捕獲、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析等,。例如,，在文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中，將提取的基因組DN**段化后,，在片段兩端連接上特定的接頭序列,，這些接頭序列可以用于后續(xù)的擴(kuò)增和測(cè)序反應(yīng)。然后通過(guò)與外顯子區(qū)域互補(bǔ)的寡核苷酸探針,，將外顯子片段從全基因組DNA文庫(kù)中“捕獲”出來(lái),，經(jīng)過(guò)清洗去除未結(jié)合的DN**段后，對(duì)捕獲的外顯子文庫(kù)進(jìn)行大規(guī)模的平行測(cè)序,。二代測(cè)序的特征是高通量,，降低了測(cè)序成本的同時(shí)，還大幅提高了測(cè)序速度,。

二代測(cè)序——轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的實(shí)驗(yàn)流程（上）

樣本采集和 RNA 提取

樣本采集需要考慮研究目的和樣本類型,。例如，研究**組織的轉(zhuǎn)錄組,，就要準(zhǔn)確獲取**組織樣本,，同時(shí)比較好有對(duì)應(yīng)的正常組織作為對(duì)照。RNA 提取方法有多種,，常用的如 Trizol 法,，它可以有效地從細(xì)胞或組織中提取總 RNA，包括 mRNA,、rRNA 和 tRNA 等,。提取后的 RNA 質(zhì)量至關(guān)重要,，需要通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳或?qū)ｉT(mén)的 RNA 質(zhì)量檢測(cè)儀器來(lái)評(píng)估 RNA 的完整性和純度。

RNA 質(zhì)量檢測(cè)和定量

完整性方面,，通常使用 RNA 完整性指數(shù)（RIN）來(lái)衡量,。RIN 值越高（一般認(rèn)為 RIN > 7 是高質(zhì)量 RNA），說(shuō)明 RNA 完整性越好,。定量方法主要有紫外分光光度法和熒光定量法,。紫外分光光度法可以通過(guò)測(cè)量 RNA 在 260nm 和 280nm 處的吸光度比值來(lái)估計(jì) RNA 純度，比值在 1.8 - 2.0 之間表示純度較好,。熒光定量法則是使用專門(mén)的熒光染料（如 Qubit）來(lái)更準(zhǔn)確地測(cè)量 RNA 濃度,。

文庫(kù)構(gòu)建

首先要進(jìn)行mRNA富集，一般使用帶有poly-T的磁珠來(lái)特異性地捕獲mRNA,，因?yàn)檎婧松飉RNA的3'端都有poly-A尾巴,。然后將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再通過(guò)超聲或酶切等方法將cDNA片段化,，片段大小通常在幾百個(gè)堿基對(duì)左右,。之后在片段兩端連接上測(cè)序接頭，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)增加文庫(kù)的量,，使其達(dá)到可以上機(jī)測(cè)序的要求,。

二代測(cè)序是先打斷DNA，使其片段化,。湖北嘉安健達(dá)二代測(cè)序價(jià)格

二代測(cè)序?qū)嶒?yàn)與測(cè)序原理是什么,？海南嘉安健達(dá)二代測(cè)序分析

WES測(cè)序的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)

針對(duì)性強(qiáng)：外顯子是基因中編碼蛋白質(zhì)的序列，與遺傳特征和疾病密切相關(guān),。WES專注于測(cè)序這些區(qū)域,，能高效篩選致病基因變異，可檢測(cè)到所有外顯子區(qū)域的突變,，包括已知的致病突變和可能導(dǎo)致疾病的未知突變,。

經(jīng)濟(jì)高效：外顯子區(qū)域*占全基因組1%左右，相比全基因組測(cè)序,，WES測(cè)序成本更低,、所需的測(cè)序深度較低，可以更快速地完成測(cè)序過(guò)程,，減少測(cè)序成本和檢測(cè)周期,。

檢測(cè)靈敏度高：能夠一次性檢測(cè)大量的基因突變，可檢測(cè)到低頻率（1%）的變異,，如腫瘤細(xì)胞中的體細(xì)胞突變,，對(duì)于單基因遺傳病、復(fù)雜疾病和罕見(jiàn)病等的診斷具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性,。

數(shù)據(jù)量和分析難度適中：相比于全基因組測(cè)序,，WES數(shù)據(jù)量小,，分析、存儲(chǔ)相對(duì)簡(jiǎn)單,，加速功能性變異的識(shí)別,，更易于進(jìn)行生物信息學(xué)分析和臨床解讀。 海南嘉安健達(dá)二代測(cè)序分析