外泌體分離的主要挑戰(zhàn)之一是消除納米級污染物，包括干擾外泌體標(biāo)志物解析的游離核酸和脂蛋白,。超速離心是目前分離外泌體的主要技術(shù),。盡管如此，它仍難以符合臨床應(yīng)用所需的標(biāo)準(zhǔn),，主要是由于該方法得到的外泌體純度不足,，產(chǎn)量較低，完整性欠佳且分離純化操作耗時(shí)長,。其他方法,，例如基于聚乙二醇（PEG）的沉淀，磷脂酰絲氨酸親和捕獲,，尺寸排阻色譜法和膜親和捕獲,，近年來已經(jīng)出現(xiàn)在特定的應(yīng)用中，但是只適用于特定場景。近來,，非對稱流場-流分離方法已被用于從細(xì)胞和瘤子培養(yǎng)基中高分辨率地分選EV亞群,，但其通量受到繁瑣的樣品制備程序的影響。單一分析耗時(shí)的過程也限制了其普遍的應(yīng)用,。因此,，目前亟需開發(fā)創(chuàng)新技術(shù)以提高外泌體分離純化的效率，純度,，產(chǎn)量,，速度和耐用性?；诔瑸V的技術(shù)提供了潛在的有前途的替代方法,，但它們也有缺點(diǎn)。在切向流過濾中,，使進(jìn)料流平行于多孔膜流動，以避免堵塞,。然而,，盡管已實(shí)現(xiàn)使用切向流過濾從大量條件細(xì)胞培養(yǎng)基中濃縮外泌體，但受制于其一次性模塊的成本高,，高剪切應(yīng)力,，難以處理小體積樣品等因素而難以應(yīng)用于臨床分析。外泌體作為蛋白質(zhì)的藥物遞送載體,。如何檢測外泌體

外泌體的納米球膜型結(jié)構(gòu)由雙層脂質(zhì)形成,。它也由各種類型的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，這些脂質(zhì)和蛋白質(zhì)衍生自形成外泌體的親代細(xì)胞,。根據(jù)外泌體數(shù)據(jù)庫ExoCarta的資料,，目前已知約有8000種蛋白質(zhì)和194種脂質(zhì)與外泌體相關(guān)。外泌體通過生物體液被多種不同類型的細(xì)胞分泌,，包括滑膜液,，母乳，血液,，尿液,，唾液，羊水和血液中的血清,，這表明它們在細(xì)胞間通訊和觸發(fā)生理反應(yīng)中起著重要的作用,。外泌體功能在研究初期階段發(fā)現(xiàn)是參與細(xì)胞成熟過程中去除不必要的蛋白質(zhì)。簡而言之,，它們是天然膜囊泡,，將蛋白質(zhì)，RNA，DNA和脂質(zhì)從一個(gè)細(xì)胞攜帶到另一個(gè)細(xì)胞,，調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物功能,。海洋生物外泌體熒光標(biāo)記建立外泌體分離、表征以及效價(jià)測定的標(biāo)準(zhǔn)化方法將是外泌體作為診斷和診療用途之前需要解決的問題,。

質(zhì)膜的連續(xù)內(nèi)陷較終導(dǎo)致多泡體的形成,，多泡體可與細(xì)胞內(nèi)的其他囊泡和細(xì)胞器交叉，從而增加了外泌體成分的多樣性,。根據(jù)細(xì)胞來源的不同,，細(xì)胞外囊泡，包括外泌體,，可以包含細(xì)胞的許多成分,，包括DNA、RNA,、脂質(zhì),、代謝物、胞質(zhì)和細(xì)胞表面蛋白,。目前產(chǎn)生外泌體的生理目的尚不清楚,，需要進(jìn)一步研究。一個(gè)推測的作用是外泌體可能從細(xì)胞中去除多余和/或不必要的成分以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,。較近的研究也表明外泌體中特定細(xì)胞成分的功能,、靶向、機(jī)制驅(qū)動的積累,，提示它們在調(diào)節(jié)細(xì)胞間通訊中發(fā)揮作用,。

外泌體病毒傳染：外泌體可以限制或促進(jìn)病毒傳染。如IFNα或APOBEC3G等外泌體載體可通過限制病毒復(fù)制或增強(qiáng)抗病毒免疫來阻止傳染,。病毒也可以劫持外泌體的生物發(fā)生機(jī)制來促進(jìn)病毒的傳播,。外泌體可以作為一個(gè)假包膜，通過四聚體蛋白(CD81,CD9)和PtSer相互作用增強(qiáng)病毒進(jìn)入受體細(xì)胞,，并幫助逃避抗病毒免疫,。病毒組分(蛋白質(zhì)和miRNA)的共轉(zhuǎn)運(yùn)也可能增強(qiáng)傳染性。外泌體介導(dǎo)的病毒轉(zhuǎn)移可能參與了病毒的遺傳協(xié)同和多重傳染.(CMV,巨細(xì)胞病毒,；HSV-1,1型皰疹病毒),。外泌體的提取的方式：PS親和法。

磁珠免疫法分離外泌體：將針對目的抗原的抗體通過生物素-鏈霉親和素連接到磁珠表面,，然后將磁珠與樣品共孵育,，使外泌體特異性結(jié)合到磁珠上形成磁珠-外泌體復(fù)合物，再用蒸餾水或者PBS沖洗,，結(jié)尾用甘氨酸-Tris-HCl溶液洗脫獲得外泌體,。該方法相對于ELISA的好處主要是,，珠粒提供了更大的表面積來捕獲外泌體，從而提高了分離效率,。此外,，使用磁珠時(shí)，樣品起始體積沒有上限,，而基于微孔板的ELISA分析的較大樣品體積為100μL,，且ELISA洗脫雜質(zhì)時(shí)容易造成孔間交叉污染。當(dāng)將磁珠法與金標(biāo)準(zhǔn)外泌體分離方法進(jìn)行比較時(shí),，磁珠法可分離出更純凈的外泌體,，特異性高、速度更快,，并且不需要昂貴的儀器,。另外，與其他分離方法（如超速離心或超濾）相比,，磁珠法不影響外泌體形態(tài),。但是采用磁珠法時(shí)，外泌體生物活性易受PH和鹽濃度影響,。利用外泌體自身的物理化學(xué)性質(zhì)所研發(fā)的各種市售的外泌體分離提取試劑盒也能達(dá)到分離效果,。安徽外泌體攝取

外泌體功能在研究初期階段發(fā)現(xiàn)是參與細(xì)胞成熟過程中去除不必要的蛋白質(zhì)。如何檢測外泌體

流式細(xì)胞技術(shù)是細(xì)胞和小顆粒定性和定量表征的有效方法,，其用于外泌體定量檢測的準(zhǔn)確性也在不斷上升。將外泌體表面特異性標(biāo)志物CD63,、CD81等相應(yīng)抗體進(jìn)行標(biāo)記,，可用流式細(xì)胞儀檢測到陽性表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對外泌體的定量,。但流式細(xì)胞技術(shù)檢測時(shí)需要單顆粒懸浮液,，當(dāng)外泌體濃度高或分離過程中發(fā)生外泌體囊泡聚集時(shí)將導(dǎo)致一次觀察到多個(gè)顆粒，從而導(dǎo)致數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確,。因此,，為了通過流式細(xì)胞儀觀察，需要將外泌體通過免疫捕獲或共價(jià)結(jié)合固定在磁珠表面上,，從而便于將外泌體囊泡暴露于已知或者預(yù)期在外泌體表面表達(dá)的抗原的熒光偶聯(lián)抗體中,。在流式細(xì)胞術(shù)之前，可以在落射熒光顯微鏡（EPI）下觀察與磁珠和熒光抗體偶聯(lián)的外泌體囊泡,。當(dāng)樣品通過流式細(xì)胞儀時(shí)采集熒光信號,，不只可以對外泌體進(jìn)行高通量分析，還可以基于抗原表達(dá)對外泌體進(jìn)行定量或分類,。如何檢測外泌體

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