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來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2023-02-27

磁珠免疫法分離外泌體:將針對(duì)目的抗原的抗體通過(guò)生物素-鏈霉親和素連接到磁珠表面,然后將磁珠與樣品共孵育,,使外泌體特異性結(jié)合到磁珠上形成磁珠-外泌體復(fù)合物,,再用蒸餾水或者PBS沖洗,結(jié)尾用甘氨酸-Tris-HCl溶液洗脫獲得外泌體,。該方法相對(duì)于ELISA的好處主要是,珠粒提供了更大的表面積來(lái)捕獲外泌體,從而提高了分離效率,。此外,使用磁珠時(shí),,樣品起始體積沒(méi)有上限,,而基于微孔板的ELISA分析的較大樣品體積為100μL,且ELISA洗脫雜質(zhì)時(shí)容易造成孔間交叉污染,。當(dāng)將磁珠法與金標(biāo)準(zhǔn)外泌體分離方法進(jìn)行比較時(shí),,磁珠法可分離出更純凈的外泌體,特異性高,、速度更快,,并且不需要昂貴的儀器。另外,,與其他分離方法(如超速離心或超濾)相比,,磁珠法不影響外泌體形態(tài),。但是采用磁珠法時(shí),外泌體生物活性易受PH和鹽濃度影響,。外泌體膜蛋白可以被蛋白酶剪切,,剪切的碎片可以作為配體與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合,從而活躍細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路,。外周血外泌體提取試劑盒成分

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外泌體分離的主要挑戰(zhàn)之一是消除納米級(jí)污染物,,包括干擾外泌體標(biāo)志物解析的游離核酸和脂蛋白。超速離心是目前分離外泌體的主要技術(shù),。盡管如此,,它仍難以符合臨床應(yīng)用所需的標(biāo)準(zhǔn),主要是由于該方法得到的外泌體純度不足,,產(chǎn)量較低,,完整性欠佳且分離純化操作耗時(shí)長(zhǎng)。其他方法,,例如基于聚乙二醇(PEG)的沉淀,,磷脂酰絲氨酸親和捕獲,尺寸排阻色譜法和膜親和捕獲,,近年來(lái)已經(jīng)出現(xiàn)在特定的應(yīng)用中,,但是只適用于特定場(chǎng)景。近來(lái),,非對(duì)稱流場(chǎng)-流分離方法已被用于從細(xì)胞和瘤子培養(yǎng)基中高分辨率地分選EV亞群,,但其通量受到繁瑣的樣品制備程序的影響。單一分析耗時(shí)的過(guò)程也限制了其普遍的應(yīng)用,。因此,,目前亟需開(kāi)發(fā)創(chuàng)新技術(shù)以提高外泌體分離純化的效率,純度,,產(chǎn)量,,速度和耐用性?;诔瑸V的技術(shù)提供了潛在的有前途的替代方法,,但它們也有缺點(diǎn)。在切向流過(guò)濾中,,使進(jìn)料流平行于多孔膜流動(dòng),,以避免堵塞。然而,,盡管已實(shí)現(xiàn)使用切向流過(guò)濾從大量條件細(xì)胞培養(yǎng)基中濃縮外泌體,,但受制于其一次性模塊的成本高,高剪切應(yīng)力,,難以處理小體積樣品等因素而難以應(yīng)用于臨床分析,。外泌體在國(guó)內(nèi)是什么時(shí)候開(kāi)始用的外泌體的提取的方式:密度梯度離心法,。

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外泌體的納米球膜型結(jié)構(gòu)由雙層脂質(zhì)形成。它也由各種類(lèi)型的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成,,這些脂質(zhì)和蛋白質(zhì)衍生自形成外泌體的親代細(xì)胞,。根據(jù)外泌體數(shù)據(jù)庫(kù)ExoCarta的資料,目前已知約有8000種蛋白質(zhì)和194種脂質(zhì)與外泌體相關(guān),。外泌體通過(guò)生物體液被多種不同類(lèi)型的細(xì)胞分泌,,包括滑膜液,母乳,,血液,,尿液,唾液,,羊水和血液中的血清,,這表明它們?cè)诩?xì)胞間通訊和觸發(fā)生理反應(yīng)中起著重要的作用。外泌體功能在研究初期階段發(fā)現(xiàn)是參與細(xì)胞成熟過(guò)程中去除不必要的蛋白質(zhì),。簡(jiǎn)而言之,,它們是天然膜囊泡,將蛋白質(zhì),,RNA,,DNA和脂質(zhì)從一個(gè)細(xì)胞攜帶到另一個(gè)細(xì)胞,調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物功能,。

細(xì)胞攝取診療性外泌體:從樹(shù)突狀細(xì)胞,、成纖維細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞中分離出的診療性外泌體可對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生特定的作用,包括新抗原呈遞,、免疫調(diào)節(jié)和藥物有效載荷傳遞,。診療性外泌體對(duì)靶細(xì)胞的影響可能是通過(guò)不同的進(jìn)入或相互作用機(jī)制來(lái)控制的。完整的外泌體的進(jìn)入可能包括受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用,、網(wǎng)格蛋白包被小凹,、脂筏,、吞噬作用,、小凹和大胞飲作用。外泌體內(nèi)容物的進(jìn)入或外泌體信號(hào)的誘導(dǎo)可能涉及配體受體誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)或融合,,從而將外泌體內(nèi)容物沉積到細(xì)胞質(zhì)中。外泌體可通過(guò)其攜帶的蛋白質(zhì),、核酸,、脂類(lèi)等來(lái)調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物學(xué)活性。

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外泌體中常見(jiàn)的細(xì)胞質(zhì)蛋白是Rabs蛋白,,是鳥(niǎo)苷酸三磷酸酶家族的一種,。它可以調(diào)節(jié)外泌體膜與受體細(xì)胞的融合,,有文獻(xiàn)報(bào)道稱RAB4,RAB5和RAB11主要出現(xiàn)在早期以及回收的核內(nèi)體中,RAB7和RAB9主要出現(xiàn)在晚期的核內(nèi)體?,F(xiàn)有大量的研究發(fā)現(xiàn)外泌體中含有40種RAB蛋白,。除了RAB蛋白,外泌體中富含具有外泌體膜交換以及融合作用的膜聯(lián)蛋白(包括膜聯(lián)蛋白1,、2,、4、5,、6,、7、11等),。外泌體膜上富含參與外泌體運(yùn)輸?shù)乃目缒さ鞍准易澹–D63,CD81和CD9)),、熱休克蛋白家族((HSP60,HSP70,HSPA5,CCT2和HSP90以及一些細(xì)胞特異性的蛋白包括A33(結(jié)腸上皮細(xì)胞來(lái)源)、MHC-Ⅱ(抗原提呈細(xì)胞來(lái)源),、CD86(抗原提呈細(xì)胞來(lái)源)以及乳凝集素(不成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞),。外泌體發(fā)揮功能:將細(xì)胞或組織中多余的或者有害的分子排除,這為研究生物標(biāo)志物提供了可能,。外泌體的提取的方式:PS親和法,。血液外泌體示蹤

提取的外泌體的鑒定方式主要是通過(guò)形態(tài)學(xué)(電子顯微鏡技術(shù))、粒子大小以及標(biāo)志蛋白等方式實(shí)現(xiàn)的,。外周血外泌體提取試劑盒成分

外泌體的相關(guān)成分:1,、外泌體的膜同細(xì)胞一樣,是磷脂雙分子層,。2,、外泌體膜含有MHC-1/2蛋白,能綁定特異性的肽鏈,。3,、外泌體膜中有跨膜蛋白PGRL、LAMP1,、LAMP2,。4、外泌體膜中有膜轉(zhuǎn)運(yùn)融合蛋白annexins,、RAN,、GTPases。5,、外泌體膜上有脂質(zhì)筏Chol,、ceramide、SM、PC,,限制膜流動(dòng),,參與包括跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)內(nèi)吞,、脂質(zhì)及蛋白定向分選的多種功能,。6、外泌體中含有核酸,,包括miRNA,、DNA、lncRNA,、mRNA,;同時(shí)還有一些蛋白、脂類(lèi)也能被包裹到外泌體中,。7,、與外泌體產(chǎn)生相關(guān)的重要分子:Ral、ARF6,、PLD2,、RAB家族。8,、一些物質(zhì)進(jìn)行外泌體中是特異性的:如hnRNPA2B1能結(jié)合lncRNA或miRNA特異性的序列(GGAG/CCCU),,進(jìn)行主動(dòng)包埋。超速離心是目前分離外泌體的主要技術(shù),。外周血外泌體提取試劑盒成分

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