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干細(xì)胞外泌體提取

來源: 發(fā)布時間:2023-04-02

外泌體的來源與特征:外泌體是一種存在于細(xì)胞外的多囊泡體,通過細(xì)胞內(nèi)吞泡膜向內(nèi)凹陷形成,其大小均一,,直徑為40-100nm,密度為1.10-1.18g/mL,。外泌體可由間充質(zhì)干細(xì)胞,、淋巴細(xì)胞和腫細(xì)胞細(xì)胞等多種類型細(xì)胞主動分泌釋放。外泌體內(nèi)主要含有核酸,、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等,,可作為疾病診斷標(biāo)記物、調(diào)控靶細(xì)胞功能,、參與細(xì)胞生物學(xué)活動等,。例如:含有miR-140-5p的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體(SMSC-Exo影響軟骨組織再生;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體攜帶的miR-196a可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化促進(jìn)大鼠顱骨缺損的骨再生,。外泌體作為核酸的藥物遞送載體,。外泌體發(fā)揮功能:將細(xì)胞或組織中多余的或者有害的分子排除,這為研究生物標(biāo)志物提供了可能,。干細(xì)胞外泌體提取

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外泌體的提取分離方法:1,、超濾離心:由于外泌體是一個大小約幾十納米的囊狀小體,大于一般蛋白質(zhì),,利用不同截留相對分子質(zhì)量(MWCO)的超濾膜對樣品進(jìn)行選擇性分離,,便可獲得外泌體。超濾離心法簡單高效,,且不影響外泌體的生物活性,,是提取細(xì)胞外泌體的一種新方法。2,、磁珠免疫法:外泌體表面有其特異性標(biāo)記物(如CD63,、CD9蛋白),用包被抗標(biāo)記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結(jié)合,,即可將外泌體吸附并分離出來,。磁珠法具有特異性高、操作簡便,、不影響外泌體形態(tài)完整等優(yōu)點(diǎn),,但是效率低,外泌體生物活性易受pH和鹽濃度影響,,不利于下游實(shí)驗(yàn),,難以普遍普及。乳液提取試劑盒步驟外泌體發(fā)揮功能方式:細(xì)胞-細(xì)胞之間的通訊,,譬如抗原遞呈,,這是發(fā)揮功能的主要方式,。

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磁珠免疫法分離外泌體:將針對目的抗原的抗體通過生物素-鏈霉親和素連接到磁珠表面,然后將磁珠與樣品共孵育,,使外泌體特異性結(jié)合到磁珠上形成磁珠-外泌體復(fù)合物,,再用蒸餾水或者PBS沖洗,結(jié)尾用甘氨酸-Tris-HCl溶液洗脫獲得外泌體,。該方法相對于ELISA的好處主要是,,珠粒提供了更大的表面積來捕獲外泌體,從而提高了分離效率,。此外,,使用磁珠時,樣品起始體積沒有上限,,而基于微孔板的ELISA分析的較大樣品體積為100μL,,且ELISA洗脫雜質(zhì)時容易造成孔間交叉污染。當(dāng)將磁珠法與金標(biāo)準(zhǔn)外泌體分離方法進(jìn)行比較時,,磁珠法可分離出更純凈的外泌體,特異性高,、速度更快,,并且不需要昂貴的儀器。另外,,與其他分離方法相比,,磁珠法不影響外泌體形態(tài)。但是采用磁珠法時,,外泌體生物活性易受PH和鹽濃度影響,。

外泌體的提取、純化和鑒定:每一個外泌體研究者較初都要為外泌體的分離提取而煩惱,。選擇的分離方式是利用超速離心的方式分離外泌體,,并且可以選用梯度密度離心法得到純度更高的外泌體。另外利用外泌體自身的物理化學(xué)性質(zhì)所研發(fā)的各種市售的外泌體分離提取試劑盒也能達(dá)到分離效果,。提取的外泌體的鑒定方式主要是通過形態(tài)學(xué)(電子顯微鏡技術(shù)),、粒子大小以及標(biāo)志蛋白等方式實(shí)現(xiàn)的。近來的研究發(fā)現(xiàn)外泌體在比較多生理病理上起著重要的作用,,如免疫中抗原呈遞,、瘤子的生長與遷移、組織損傷的修復(fù)等,。不同細(xì)胞分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能,,可作為疾病診斷的生物標(biāo)志物。外泌體具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu),,能比較好的保護(hù)其包被的物質(zhì),,且能靶向特定細(xì)胞或組織,,因此是一種比較好靶向給藥系統(tǒng)。外泌體膜蛋白可以被蛋白酶剪切,,剪切的碎片可以作為配體與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合,,從而活躍細(xì)胞內(nèi)的信號通路。

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外泌體的提取分離方法:1,、PEG-base沉淀法:聚乙二醇(PEG)可與疏水性蛋白和脂質(zhì)分子結(jié)合共沉淀,,早先應(yīng)用于從血清等樣本中收集病毒,現(xiàn)在也被用來沉淀外泌體,,其原理可能與競爭性結(jié)合游離水分子有關(guān),。利用PEG沉淀外泌體存在不少問題:比如純度和回收率低,雜蛋白較多(假陽性),,顆粒大小不均一,,產(chǎn)生難以去除的聚合物,機(jī)械力或者吐溫-20等化學(xué)添加物將會破壞外泌體等,,因此發(fā)表文章時易受質(zhì)疑,。2、試劑盒提?。航鼛啄陙?,市場上已出現(xiàn)各種商業(yè)化的外泌體提取試劑盒,有的是通過特殊設(shè)計(jì)的過濾器過濾掉雜質(zhì)成分,,有的則采用空間排阻色譜法(SEC)進(jìn)行分離純化,,也有的則利用化合物沉淀將法外泌體沉淀出來。選擇的分離方式是利用超速離心的方式分離外泌體,,并且可以選用梯度密度離心法得到純度更高的外泌體,。牛奶提取試劑盒應(yīng)用

外泌體的作用是消除廢物并介導(dǎo)大腦活動,從而阻止神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)理,。干細(xì)胞外泌體提取

外泌體的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成可以影響它們的藥代動力學(xué)特性,,它們的天然成分可能在提高生物利用度和減少不良反應(yīng)方面發(fā)揮作用。除了它們的診療潛力,,外泌體也有幫助疾病診斷的潛力,。它們已經(jīng)在所有的生物液體中被報(bào)道,并且通過生物液體取樣(液體活組織檢查)可以比較容易地獲得外泌體的復(fù)雜貨物的組成,?;谕饷隗w的液體活檢在病癥和其他疾病的診斷和確定預(yù)后方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。疾病的進(jìn)展和對診療的反應(yīng)也可以通過外泌體的多組分分析來確定,。干細(xì)胞外泌體提取

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