透射電子顯微鏡(TEM)和掃描電子顯微鏡(SEM)是用于評估外泌體形態(tài),、大小和表型的的兩種常見的電子顯微鏡,。SEM和TEM均使用電子束產(chǎn)生高分辨率的亞微米顆粒放大圖像,以區(qū)分外泌體與殘留在樣品中相似大小的非外泌體顆粒,,該方法還可用于檢查樣品的純度,。TEM與SEM之間的區(qū)別在于檢測電子類別,在SEM中,,電子與樣品中的粒子相互作用時(shí)會(huì)發(fā)生散射,捕獲并檢測散射的電子,,從而生成粒子圖像,。但是,在TEM中,,不與粒子相互作用的電子穿過樣品,,并使用熒光屏進(jìn)行檢測。電子顯微鏡下外泌體大小不一,,通常呈茶托樣的圓形或橢圓形,。采用電子顯微鏡檢測外泌體時(shí)對樣品的預(yù)處理和制備要求較高,外泌體的提取方法和品質(zhì)會(huì)對電鏡結(jié)果造成影響,;另外樣品的準(zhǔn)備階段比較復(fù)雜,,不適合進(jìn)行大量快速的測量;而且由于樣本經(jīng)過了干燥,、固定以及冷凍等預(yù)處理和制備過程,,對生物樣本的結(jié)構(gòu)會(huì)造成一定的破壞,從而影響觀察的效果,,無法準(zhǔn)確測量外泌體濃度,。安徽植物外泌體鑒定磁珠免疫法分離的外泌體,生物活性易受pH和鹽濃度影響,,不利于下游實(shí)驗(yàn),,難以普遍普及。超速離心法,,這是目前外泌體提取較常用的方法,。羊奶提取試劑盒銷售
外泌體的提取分離方法:1、PEG-base沉淀法:聚乙二醇(PEG)可與疏水性蛋白和脂質(zhì)分子結(jié)合共沉淀,,早先應(yīng)用于從血清等樣本中收集病毒,,現(xiàn)在也被用來沉淀外泌體,其原理可能與競爭性結(jié)合游離水分子有關(guān),。利用PEG沉淀外泌體存在不少問題:比如純度和回收率低,,雜蛋白較多(假陽性),顆粒大小不均一,,產(chǎn)生難以去除的聚合物,,機(jī)械力或者吐溫-20等化學(xué)添加物將會(huì)破壞外泌體等,,因此發(fā)表文章時(shí)易受質(zhì)疑。2,、試劑盒提?。航鼛啄陙恚袌錾弦殉霈F(xiàn)各種商業(yè)化的外泌體提取試劑盒,,有的是通過特殊設(shè)計(jì)的過濾器過濾掉雜質(zhì)成分,,有的則采用空間排阻色譜法(SEC)進(jìn)行分離純化,也有的則利用化合物沉淀將法外泌體沉淀出來,。浙江外泌體Dil外泌體的納米球膜型結(jié)構(gòu)由雙層脂質(zhì)形成,。
外泌體(Exosomes)是細(xì)胞分泌到胞外的一種囊泡(ExtracellularVesicles,EVs),,其大小為30-150nm,,具有雙層膜結(jié)構(gòu)和茶托狀形態(tài),含有豐富的內(nèi)含物(包括核酸,、蛋白和脂質(zhì)等),,參與細(xì)胞間的分子傳遞。外泌體普遍存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清以及各種體液中,,包括血液,、唾液、尿液,、乳汁等,,同時(shí)也存在于組織樣本中,如腦組織,、肌肉組織,、脂肪組織等。腦組織分離方法簡述:將腦組織剪成薄片,,放入離心管中加上消化液進(jìn)行消化,,經(jīng)水浴、反復(fù)輕輕上下顛倒,,再用移液間斷緩慢吹吸至消化結(jié)束,。隨后加入培養(yǎng)基于消化液中,混勻,,置于冰上,。再進(jìn)行一系列的差速超速離心過程,包括除雜,、濾膜過濾,、超離等。結(jié)尾用PBS重懸外泌體,,用重懸后的外泌體進(jìn)行下面的透射電鏡(TEM),、納米粒徑追蹤分子(NTA)和markerWB鑒定,。
AFC自動(dòng)收集器是將qEV分離法這一過程自動(dòng)化的儀器,將用來收集外泌體樣本的微量離心管放置在AFC的中間轉(zhuǎn)盤內(nèi),,根據(jù)稱重精確測量流體體積,,可精確的測量到樣品中每一個(gè)液滴的重量并精確測量總重量。將在空隙體積之前從qEV柱洗脫的流體收集到AFC轉(zhuǎn)盤的單獨(dú)中心孔中并送至廢液桶,,避免將不需要的空隙部分收集到微量離心管中,。在提取期間,當(dāng)達(dá)到設(shè)定的提取體積后,,轉(zhuǎn)盤會(huì)自動(dòng)旋轉(zhuǎn)到下一個(gè)微量離心管繼續(xù)收集,,到收集完成后自動(dòng)停止。微滴式數(shù)字PCR技術(shù)不佳有效提高了核酸分子的擴(kuò)增效率,,而且由于采用微滴計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行定量,可以不依賴與RT-PCR的熒光信號和Ct值,,對所測樣品中的核酸分子進(jìn)行一定定量,。外泌體具有抗原提呈、免疫逃逸,、誘導(dǎo)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化,、促進(jìn)瘤子發(fā)生和轉(zhuǎn)移等作用。
DLS使用由于粒子的布朗運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生的波動(dòng)散射光的強(qiáng)度來估計(jì)外泌體顆粒的大小分布及其zeta電位,。DLS樣品制備方便,,只需要簡單的過濾,測量速度較快,,需要的樣品體積較少,。但由于動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)是基于光強(qiáng)測量,散射光的強(qiáng)度與粒徑的六次方成正比,,使得當(dāng)測量多種粒徑的混合懸浮液時(shí),,通常會(huì)偏向于檢測較大粒徑產(chǎn)生的散射光,比較難檢測到較小顆粒,。所以DLS不適合對粒徑分布較寬的外泌體樣本的測量,,只適合尺寸較為均一的外泌體樣本,并且無法測量樣品中外泌體的濃度,。外泌體的提取的方式:過濾離心,。植物外泌體Dil
外泌體產(chǎn)生于細(xì)胞中的多泡體。羊奶提取試劑盒銷售
流式細(xì)胞技術(shù)是細(xì)胞和小顆粒定性和定量表征的有效方法,,其用于外泌體定量檢測的準(zhǔn)確性也在不斷上升,。將外泌體表面特異性標(biāo)志物CD63、CD81等相應(yīng)抗體進(jìn)行標(biāo)記,,可用流式細(xì)胞儀檢測到陽性表達(dá),,從而實(shí)現(xiàn)對外泌體的定量,。但流式細(xì)胞技術(shù)檢測時(shí)需要單顆粒懸浮液,當(dāng)外泌體濃度高或分離過程中發(fā)生外泌體囊泡聚集時(shí)將導(dǎo)致一次觀察到多個(gè)顆粒,,從而導(dǎo)致數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確,。因此,為了通過流式細(xì)胞儀觀察,,需要將外泌體通過免疫捕獲或共價(jià)結(jié)合固定在磁珠表面上,,從而便于將外泌體囊泡暴露于已知或者預(yù)期在外泌體表面表達(dá)的抗原的熒光偶聯(lián)抗體中。在流式細(xì)胞術(shù)之前,,可在落射熒光顯微鏡(EPI)下觀察與磁珠和熒光抗體偶聯(lián)的外泌體囊泡,。當(dāng)樣品通過流式細(xì)胞儀時(shí)采集熒光信號,不只可以對外泌體進(jìn)行高通量分析,,還可以基于抗原表達(dá)對外泌體進(jìn)行定量或分類,。羊奶提取試劑盒銷售
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