以piezo操作系統(tǒng)為技術(shù)支撐,，在掌握小鼠卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)(ICSI)的基礎(chǔ)上,，進(jìn)行了ICSI技術(shù)生產(chǎn)試管小鼠及轉(zhuǎn)基因小鼠的嘗試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以Hepes-CZB+3％蔗糖做操作液,，用來(lái)自成年KM鼠附睪尾的新鮮精子頭和pEGFP-N1質(zhì)粒孵育處理凍融精子頭,，直接注射到B6D2F1小鼠卵母細(xì)胞質(zhì)中，注射后1h,，83.3％的卵母細(xì)胞仍然存活,，鮮精組和凍精組各有92.3％和83.0％成活卵子排出極體、出現(xiàn)原核,。用CZB溶液繼續(xù)培養(yǎng)ICSI胚胎,，兩組的卵裂率、桑椹胚率,、囊胚率分別為(97.8％vs94.7％),、(64％vs64.5％),、(5％，vs24.7％),。其中桑椹胚率,、囊胚率均***低于體內(nèi)受精對(duì)照組(64％，64.5％vs88％,；5％,，24.7％vs70％P＜0.01)；將鮮精組原核期120枚胚胎和82枚2-cell胚胎及凍精組135枚原核期胚胎移植后移植到同期km假孕母鼠受體內(nèi),，分別出生28只,、3只、18只ICSI小鼠(黑色或灰色),，效率分別為23.3％,，4％，13.3％,。健康成年的31只ICSI小鼠,，沒(méi)有明顯的生理和行為異常。隨機(jī)抽取六對(duì)鮮精組性成熟ICSI小鼠做交配實(shí)驗(yàn),，一個(gè)月后都有小鼠出生(平均窩產(chǎn)10.7只),。本實(shí)驗(yàn)表明，ICSI精子載體法可以比較高地制造小鼠轉(zhuǎn)基因胚胎,，小鼠附睪新鮮精子及無(wú)抗凍劑保護(hù)冷凍致死精子都具有足夠的全程發(fā)育潛力,。PMM通過(guò)將精子尾部與頭部割離,精子頭部吸入平口,在中低檔能量下即可穿透透明帶,進(jìn)行單精子顯微注射。美國(guó)透明帶穿孔壓電單精注射

壓電式破膜儀的規(guī)范操作需兼顧樣本安全與設(shè)備精確度,，以下為標(biāo)準(zhǔn)流程及注意事項(xiàng)：一,、操作前準(zhǔn)備設(shè)備檢查確認(rèn)電源接地良好，開(kāi)機(jī)預(yù)熱使壓電元件達(dá)到熱穩(wěn)定狀態(tài),，觀察屏幕顯示參數(shù),；安裝適配探頭，擰緊固定螺帽后輕晃探頭,，確保無(wú)松動(dòng)（晃動(dòng)幅度≤0.1mm）,。樣本預(yù)處理細(xì)胞樣本需制備成單細(xì)胞懸液，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿,。二,、主要操作流程參數(shù)設(shè)置根據(jù)樣本類型調(diào)節(jié)頻率、振幅（1-5μm）及脈沖時(shí)長(zhǎng)（10-50ms）,，建議先在標(biāo)準(zhǔn)微球上測(cè)試破膜效率（穿孔率≥80%且無(wú)樣本損傷）,；開(kāi)啟顯微定向系統(tǒng)，通過(guò)三維平臺(tái)將探頭頂部對(duì)準(zhǔn)目標(biāo)區(qū)域（距離樣本0.5-1mm）,。破膜操作點(diǎn)“單次脈沖”或“連續(xù)模式”（間隔≥1秒）,，實(shí)時(shí)觀察顯微鏡下破膜效果（細(xì)胞膜出現(xiàn)短暫透光孔即為成功）,；破碎時(shí)需間歇性操作（每30秒停機(jī)冷卻10秒）,，避免產(chǎn)熱導(dǎo)致樣本變性,，同時(shí)用移液器輕晃懸液，確保破碎均勻,。三,、安全與禁忌操作禁止行為：探頭未接觸樣本時(shí)空載運(yùn)行；用探頭直接觸碰載玻片或培養(yǎng)皿底部,；處理強(qiáng)腐蝕性樣本,，否則需額外配置防腐蝕探頭及廢液回收裝置。緊急情況處理：若出現(xiàn)異常噪音（超過(guò)60dB）或屏幕報(bào)錯(cuò)（如“振幅超限”）,，立即按下急停按鈕,，斷電后檢查探頭是否卡頓或參數(shù)設(shè)置異常。上海透明帶壓電4GPMM利用壓電單元的快速形變的慣性力來(lái)驅(qū)動(dòng)顯微注射針,，可以平滑地穿透透明帶和彈性細(xì)胞膜,。

壓電效應(yīng)的原理是，如果對(duì)壓電材料施加壓力,，它便會(huì)產(chǎn)生電位差（稱之為正壓電效應(yīng)）,，反之施加電壓，則產(chǎn)生機(jī)械應(yīng)力（稱為逆壓電效應(yīng)）,。如果壓力是一種高頻震動(dòng),，則產(chǎn)生的就是高頻電流。而高頻電信號(hào)加在壓電陶瓷上時(shí),，則產(chǎn)生高頻聲信號(hào)（機(jī)械震動(dòng)）,，這就是我們平常所說(shuō)的超聲波信號(hào)。也就是說(shuō),，壓電陶瓷具有機(jī)械能與電能之間的轉(zhuǎn)換和逆轉(zhuǎn)換的功能,，這種相互對(duì)應(yīng)的關(guān)系確實(shí)非常有意思。壓電材料可以因機(jī)械變形產(chǎn)生電場(chǎng),，也可以因電場(chǎng)作用產(chǎn)生機(jī)械變形,，這種固有的機(jī)-電耦合效應(yīng)使得壓電材料在工程中得到了廣泛的應(yīng)用。例如,，壓電材料已被用來(lái)制作智能結(jié)構(gòu),，此類結(jié)構(gòu)除具有自承載能力外，還具有自診斷性,、自適應(yīng)性和自修復(fù)性等功能,，在未來(lái)的飛行器設(shè)計(jì)中占有重要的地位。

高效破膜：能通過(guò)產(chǎn)生高頻振動(dòng),，精確地作用于細(xì)胞膜,，使細(xì)胞膜迅速破裂,，可提高細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放效率，如在提取細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì),、核酸等生物大分子時(shí)表現(xiàn)出色,。溫和性好：相較于一些傳統(tǒng)的破膜方法，如機(jī)械破碎,、化學(xué)試劑處理等,，PIEZO 壓電破膜儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生物分子傷害較小，能很好地保持生物分子的活性和結(jié)構(gòu)完整性,，有利于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析和研究,。操作簡(jiǎn)便：儀器的操作界面通常較為簡(jiǎn)潔，參數(shù)設(shè)置直觀,，易于掌握,。實(shí)驗(yàn)人員可以根據(jù)不同的細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)需求，方便地調(diào)整破膜的強(qiáng)度,、時(shí)間等參數(shù),。可重復(fù)性高：只要按照規(guī)范操作,，設(shè)定相同的參數(shù),，該儀器能夠在多次實(shí)驗(yàn)中獲得較為穩(wěn)定一致的破膜效果，為科研實(shí)驗(yàn)提供可靠的數(shù)據(jù)支持,。壓電顯微操作器PMM利用壓電元件產(chǎn)生的驅(qū)動(dòng)力來(lái)展示其對(duì)各種樣品的優(yōu)異穿孔能力,。

Piezo-ICSI程序:使用直徑100-mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿上蓋,準(zhǔn)備操作盤；按照Piezo操作系統(tǒng)的要求,，將4μL左右的汞從后部裝入注射針中,，輕輕將汞推至針尖處，在20-25℃室溫下,，準(zhǔn)備進(jìn)行顯微操作,。具體操作前，首先取10枚卵母細(xì)胞置于15L含3%suerose的HEPES-CZB操作滴中備用,；然后將2.5μL精子溶液與5pLHEPES-CZB+12%PVP-360操作滴充分混合,；再將單個(gè)精子從尾部吸入注射針，用Piezo脈沖從頸部斷開(kāi)頭和尾,；連續(xù)剪切5個(gè)精子后,，將吸入全部精子頭的注射針轉(zhuǎn)移到放置卵母細(xì)胞的操作滴中，準(zhǔn)備將精子頭逐個(gè)注射至卵母細(xì)胞質(zhì)中,。注射時(shí),，從時(shí)鐘9點(diǎn)的方向吸住卵母細(xì)胞，使紡錘體保持在6點(diǎn)或12點(diǎn)的位置,，從3點(diǎn)的方向輕輕進(jìn)針,，同時(shí)用Piezo脈沖擊穿透明帶,，將透明帶碎片吹出注射針的同時(shí)，將精子頭吹至針尖處,，繼續(xù)進(jìn)針,，直至針尖插入卵母細(xì)胞深處，幾乎貼近對(duì)側(cè)質(zhì)膜時(shí),，用Piezo弱脈沖擊穿卵母細(xì)胞質(zhì)膜,，將精子頭吐出,，回吸注入卵內(nèi)多余的操作液,，輕輕退針，完成一次注射,。依次操作,，盡快實(shí)現(xiàn)該批卵母細(xì)胞的注射，室溫放置5min,然后用大量CZB溶液洗滌ICSI胚胎,，并且移入CO?箱培養(yǎng),。依法進(jìn)行第二批卵母細(xì)胞的精子頭注射，在注射HCG后17h,完成全部卵母細(xì)胞的精子注射,。PMM加載于顯微操作設(shè)備的注射端,，兼容性強(qiáng)，安裝簡(jiǎn)便,。Piezo Micro Manipulator壓電穩(wěn)定

通過(guò)使用PMM PIEZO-ICSI,，醫(yī)生可以更加精確地進(jìn)行受精操作，提高受孕成功率,，為患者創(chuàng)造更多的生命奇跡,。美國(guó)透明帶穿孔壓電單精注射

卵子***是人類胚胎發(fā)育的起始步驟，該過(guò)程主要由細(xì)胞內(nèi)的鈣釋放調(diào)控,，當(dāng)成熟的卵母細(xì)胞發(fā)育到MII期后,，只有精子的PLCζ進(jìn)入卵母細(xì)胞的胞漿，才能***鈣震蕩,，促使卵母細(xì)胞完成完整的減數(shù)分裂,。TFF(Totalfertilizationfailure，完全受精失敗)是指MII期卵母細(xì)胞無(wú)法完成受精的過(guò)程,，有1-3%的ICSI失敗是源于IFF,。TFF與精子及卵子的異常均有關(guān)，其中卵子***異常是主要因素,。卵子因素主要是由蛋白合成不足或異常信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致的胞質(zhì)不成熟,；精子因素主要是PLCζ蛋白的結(jié)構(gòu)、表達(dá)和定位異常,。受精失敗與女方年齡,、不育類型和取卵數(shù)目等因素?zé)o關(guān),。精子的解凝功能異常和魚(yú)精蛋白缺失與TFF密切相關(guān)。精子染色質(zhì)組裝異?；蚓覦NA損傷可導(dǎo)致精子的解凝異常,，無(wú)法***卵子及合子形成。研究表明精子染色質(zhì)組裝異常的精子中精子解凝功能受阻的精子比例高于正常精子,。精細(xì)胞染色質(zhì)的魚(yú)精蛋白的合成與組裝對(duì)于精細(xì)胞的基因組濃縮也是非常重要的,。若魚(yú)精蛋白的量減少，精子在ICSI后提前解凝,，導(dǎo)致受精失敗,。當(dāng)精子進(jìn)入卵子后精子染色質(zhì)提前濃縮也導(dǎo)致其提前解凝，精子和卵子遺傳物質(zhì)的同步節(jié)奏被打破,，也造成受精失敗,。不過(guò)這種同步性異常主要還是卵子因素造成的。美國(guó)透明帶穿孔壓電單精注射