熒光物質(zhì),，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象,，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料,。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4,，較大吸收光波長為490--495nm,，較大發(fā)射光波長520--530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu),，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率,、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,，在冷暗干燥處可保存多年,，是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感,，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色,。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末，不溶于水,，易溶于酒精,。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存,。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長為570nm,，較大發(fā)射光波長為595～600nm,，呈橘紅色熒光,。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長為550nm，較大發(fā)射光波長為620nm,，呈橙紅色熒光,。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合,，但熒光效率較低。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程,。CD11B免疫熒光

基于熒光成像的技術(shù)對于查詢細胞和組織的結(jié)構(gòu)和功能方面非常有用,。當與免疫化學(xué)結(jié)合時，熒光成像技術(shù)的分析能力增加,，增強了這種技術(shù)在普遍的研究和臨床應(yīng)用中的實用性,，使其成為寶貴的工具。免疫熒光顯微鏡通過使活細胞成像能夠可視化整個細胞器,，徹底改變了細胞生物學(xué)領(lǐng)域,。免疫組織化學(xué)和免疫細胞化學(xué)是結(jié)合抗原抗體結(jié)合能力進行細胞分析的常用熒光成像技術(shù)。免疫熒光（IF）是一種強大的免疫染色技術(shù),，利用顯微鏡觀察與靶蛋白和其他目標分子結(jié)合的熒光素標記抗體,。免疫熒光用于鑒定細胞中的細胞和組織特異性抗原；可視化蛋白質(zhì)的存在與否,、細胞定位和活化狀態(tài),；并分析免疫反應(yīng)。CD11B免疫熒光在1941年,，Coons初次成功地使用熒光素作為標記物質(zhì)進行免疫熒光實驗,。

熒光素標記抗體的方法：方法及步驟：①抗體的準備：取適量已知球蛋白濃度之溶液,，置入三角燒瓶中，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液,，使然后蛋白濃度為20mg/ml,，緩沖液容量為總量的1/10，混勻,，將三角燒瓶置冰槽中,，電磁攪拌（速度適當以不起泡沫為宜）5～10min。②熒光素的準備：根據(jù)欲標記的蛋白質(zhì)總量,，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素,，用分析天平準確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。③結(jié)合（或稱標記）：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中,，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內(nèi)加完）,，加畢后，繼續(xù)攪拌12～18h,。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右,，故須及時添冰去水；亦可將結(jié)合裝置安放在4℃冰箱或冰庫中,。

免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團在一定波長（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性,，經(jīng)過短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長發(fā)射光子，并伴隨能量損失,。發(fā)射的熒光可通過顯微鏡觀察到,。熒光團可以通過可見光或紫外光激發(fā)。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場上購買,，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長范圍,。它們不會損傷活細胞，可安全用于生物制劑,。在進行免疫熒光檢測時,，首先對細胞或組織進行固定和透化處理。進行免疫染色時,，熒光團與目標抗原的抗體結(jié)合,，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號。根據(jù)使用的抗體和所需的信號擴增,，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細胞凋亡和細胞存活。

細胞免疫熒光步驟是什么呢,？步驟：1. 細胞一定要貼在玻片上（較好可以放入24孔板）,，為后面照像打基礎(chǔ)。細胞密度適中,，大約60-75%滿片即可,，否則容易脫片,。2. 取出細胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘，現(xiàn)用現(xiàn)配,。（以下各步驟切毋使玻片干燥）3. PBS沖洗,；4. 0.1%Triton作用20分鐘；5. PBS沖洗,；6. 10%正常血清封閉10分鐘,；7. 加入一抗，4度孵育過夜（找個小瓶蓋將小玻片支起來,，抗體就不容易溢出）,，還要記住“砸片”，就是抗體從較高處落到片子上,，以分布均勻,。抗體稀釋度1：60,，較常用,！8. PBS沖洗4次，各5分鐘,；9加入熒光二抗,，室溫30分鐘,?？贵w稀釋度1：400，較常用,！10. 90%甘油封片,。也很關(guān)鍵阿，多封幾次才有體會,。12. 避光保存,，或到顯微鏡下觀察。免疫熒光技術(shù)通過熒光信號的觀察來確定抗原或抗體的分布和定位,。ucp2免疫組化IHC

免疫熒光技術(shù)中,，以熒光物質(zhì)標記抗體來定位抗原物質(zhì)的方法被稱為熒光抗體技術(shù)。CD11B免疫熒光

細胞的固定及免疫熒光：吸去一抗,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗,，37℃,，室溫避光孵育1小時。注意二抗帶有熒光素標記,，因此操作過程盡量在暗處進行,。吸去二抗,，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min,。向玻片上滴加DAPI,，或者Hoechst復(fù)染細胞核，一般為藍色熒光,；避光孵育5-10min,。使用PBS輕洗細胞3 次，每次 5 min,，洗去多余的DAPI,。取爬片時由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊，張力較大,，可將注射器針頭針尖向背面做個小鉤,，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出即可,。用吸水紙吸干爬片上的液體,，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，注意將爬片反過來貼于多聚賴氨酸載玻片上,，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,，注意選擇抗體對應(yīng)的激發(fā)光源。CD11B免疫熒光

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