熒光物質(zhì),，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素,。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料,。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑,。分子量為389.4,，較大吸收光波長為490--495nm，較大發(fā)射光波長520--530nm,，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率,、穩(wěn)定性,、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年,，是應(yīng)用較普遍的熒光素,。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色,。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末,，不溶于水，易溶于酒精,。性質(zhì)穩(wěn)定,，可長期保存。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長為570nm,，較大發(fā)射光波長為595～600nm,，呈橘紅色熒光。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長為550nm,，較大發(fā)射光波長為620nm,，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明,，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程,。CD11B免疫熒光

基于熒光成像的技術(shù)對(duì)于查詢細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)和功能方面非常有用。當(dāng)與免疫化學(xué)結(jié)合時(shí),，熒光成像技術(shù)的分析能力增加,，增強(qiáng)了這種技術(shù)在普遍的研究和臨床應(yīng)用中的實(shí)用性，使其成為寶貴的工具。免疫熒光顯微鏡通過使活細(xì)胞成像能夠可視化整個(gè)細(xì)胞器,，徹底改變了細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域,。免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)是結(jié)合抗原抗體結(jié)合能力進(jìn)行細(xì)胞分析的常用熒光成像技術(shù)。免疫熒光（IF）是一種強(qiáng)大的免疫染色技術(shù),，利用顯微鏡觀察與靶蛋白和其他目標(biāo)分子結(jié)合的熒光素標(biāo)記抗體,。免疫熒光用于鑒定細(xì)胞中的細(xì)胞和組織特異性抗原；可視化蛋白質(zhì)的存在與否,、細(xì)胞定位和活化狀態(tài),；并分析免疫反應(yīng)。CD11B免疫熒光在1941年,，Coons初次成功地使用熒光素作為標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn),。

熒光素標(biāo)記抗體的方法：方法及步驟：①抗體的準(zhǔn)備：取適量已知球蛋白濃度之溶液，置入三角燒瓶中,，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液,，使然后蛋白濃度為20mg/ml，緩沖液容量為總量的1/10,，混勻,，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌（速度適當(dāng)以不起泡沫為宜）5～10min,。②熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量,，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素，用分析天平準(zhǔn)確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末,。③結(jié)合（或稱標(biāo)記）：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中,，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內(nèi)加完），加畢后,，繼續(xù)攪拌12～18h,。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右,，故須及時(shí)添冰去水,；亦可將結(jié)合裝置安放在4℃冰箱或冰庫中。

免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團(tuán)在一定波長（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性,，經(jīng)過短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長發(fā)射光子,，并伴隨能量損失。發(fā)射的熒光可通過顯微鏡觀察到,。熒光團(tuán)可以通過可見光或紫外光激發(fā),。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場上購買，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長范圍,。它們不會(huì)損傷活細(xì)胞,，可安全用于生物制劑。在進(jìn)行免疫熒光檢測時(shí)，首先對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行固定和透化處理,。進(jìn)行免疫染色時(shí),，熒光團(tuán)與目標(biāo)抗原的抗體結(jié)合，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號(hào),。根據(jù)使用的抗體和所需的信號(hào)擴(kuò)增,，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡和細(xì)胞存活,。

細(xì)胞免疫熒光步驟是什么呢,？步驟：1. 細(xì)胞一定要貼在玻片上（較好可以放入24孔板），為后面照像打基礎(chǔ),。細(xì)胞密度適中,，大約60-75%滿片即可，否則容易脫片,。2. 取出細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘,，現(xiàn)用現(xiàn)配。（以下各步驟切毋使玻片干燥）3. PBS沖洗,；4. 0.1%Triton作用20分鐘,；5. PBS沖洗；6. 10%正常血清封閉10分鐘,；7. 加入一抗,，4度孵育過夜（找個(gè)小瓶蓋將小玻片支起來，抗體就不容易溢出）,，還要記住“砸片”,，就是抗體從較高處落到片子上，以分布均勻,?？贵w稀釋度1：60，較常用,！8. PBS沖洗4次,，各5分鐘；9加入熒光二抗,，室溫30分鐘,。抗體稀釋度1：400,，較常用,！10. 90%甘油封片。也很關(guān)鍵阿,，多封幾次才有體會(huì),。12. 避光保存,，或到顯微鏡下觀察。免疫熒光技術(shù)通過熒光信號(hào)的觀察來確定抗原或抗體的分布和定位,。ucp2免疫組化IHC

免疫熒光技術(shù)中,，以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的方法被稱為熒光抗體技術(shù)。CD11B免疫熒光

細(xì)胞的固定及免疫熒光：吸去一抗,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗,，37℃,，室溫避光孵育1小時(shí)。注意二抗帶有熒光素標(biāo)記,，因此操作過程盡量在暗處進(jìn)行,。吸去二抗，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min,。向玻片上滴加DAPI，或者Hoechst復(fù)染細(xì)胞核,，一般為藍(lán)色熒光,；避光孵育5-10min。使用PBS輕洗細(xì)胞3 次,，每次 5 min,，洗去多余的DAPI。取爬片時(shí)由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊,，張力較大,，可將注射器針頭針尖向背面做個(gè)小鉤，這樣將爬片輕輕勾起,，用小鑷子取出即可,。用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,，注意將爬片反過來貼于多聚賴氨酸載玻片上,，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，注意選擇抗體對(duì)應(yīng)的激發(fā)光源,。CD11B免疫熒光

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