免疫熒光技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng),、敏感性高,、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問(wèn)題尚未完全解決,，結(jié)果判定的客觀性不足,，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜,。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可進(jìn)一步分做若干種,。與放射免疫法相比,，熒光免疫法無(wú)放射性污染，并且大多操作簡(jiǎn)便,，便于推廣,。國(guó)外生產(chǎn)的TDM用試劑盒，有相當(dāng)一部分即屬于此類,，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生產(chǎn),。由于一般熒光測(cè)定中的本底較高等問(wèn)題，熒光免疫技術(shù)用于定量測(cè)定有一定困難,。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測(cè)定,，與酶免疫測(cè)定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用,。免疫熒光技術(shù)利用熒光染料標(biāo)記的抗體與目標(biāo)分子結(jié)合,，從而實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)。CD163免疫熒光分析

zo-1的免疫熒光,，步驟如下：1.細(xì)胞在蓋片上生長(zhǎng)融合到95%-100%時(shí),，從孵箱中取出。2.用預(yù)溫的1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。3.4%的甲醛室溫固定20-30分鐘。4.1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。5.0.2%TritonX-100透化2-5分鐘,。6.1×PBS洗3次，每次10分鐘,。7.5%BSA室溫封閉30分鐘,。8.加一抗（用1%BSA稀釋）放在濕盒里，4度過(guò)夜,。9.1×PBS洗3次,，每次10分鐘。10.加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘,，閉光,。11.1×PBS洗3次，每次10分鐘,。12.95%甘油封片,。注：4%甲醛，0.2%Triton,，5%BSA均用1×PBS稀釋,。P21免疫組化免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用，幫助揭示細(xì)胞和分子的功能和相互關(guān)系,。

細(xì)胞的固定及免疫熒光：吸去一抗,，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min,。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗,，37℃，室溫避光孵育1小時(shí),。注意二抗帶有熒光素標(biāo)記,，因此操作過(guò)程盡量在暗處進(jìn)行。吸去二抗,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min。向玻片上滴加DAPI,，或者Hoechst復(fù)染細(xì)胞核,，一般為藍(lán)色熒光；避光孵育5-10min,。使用PBS輕洗細(xì)胞3 次,，每次 5 min，洗去多余的DAPI,。取爬片時(shí)由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊,，張力較大，可將注射器針頭針尖向背面做個(gè)小鉤,，這樣將爬片輕輕勾起,，用小鑷子取出即可,。用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,，注意將爬片反過(guò)來(lái)貼于多聚賴氨酸載玻片上，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,，注意選擇抗體對(duì)應(yīng)的激發(fā)光源,。

免疫熒光通過(guò)抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原-抗體結(jié)合反應(yīng),，進(jìn)而對(duì)抗原所在的細(xì)胞或組織進(jìn)行定性或定量,。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光,，可以看見(jiàn)熒光所在的細(xì)胞或組織,，利用定量技術(shù)測(cè)定含量，從而可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定性和定位分析,。細(xì)胞免疫熒光用途：快速直觀顯示所檢測(cè)蛋白的細(xì)胞定位,。材料與儀器：樣品：貼壁細(xì)胞；試劑：4% 組織固定液,，PBS,，Triton X-100，BSA,，熒光二抗,，免疫熒光染色二抗稀釋液，抗熒光猝滅封片液,，0.25% 胰酶,；器材：6/12/24 孔板，細(xì)胞爬片（蓋玻片）,，載玻片,，15 ml 離心管。免疫熒光技術(shù)可以用于研究疾病的發(fā)生機(jī)制和醫(yī)治效果評(píng)估,。

免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團(tuán)在一定波長(zhǎng)（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性,，經(jīng)過(guò)短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長(zhǎng)發(fā)射光子，并伴隨能量損失,。發(fā)射的熒光可通過(guò)顯微鏡觀察到,。熒光團(tuán)可以通過(guò)可見(jiàn)光或紫外光激發(fā)。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi),，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長(zhǎng)范圍,。它們不會(huì)損傷活細(xì)胞，可安全用于生物制劑,。在進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)時(shí),，首先對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行固定和透化處理,。進(jìn)行免疫染色時(shí)，熒光團(tuán)與目標(biāo)抗原的抗體結(jié)合,，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號(hào),。根據(jù)使用的抗體和所需的信號(hào)擴(kuò)增，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型,。熒光抗體技術(shù)具有高靈敏度和高特異性,，可以實(shí)現(xiàn)精確的免疫檢測(cè)。Fibronectin免疫熒光檢查

早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合,，用于定位組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原物質(zhì),。CD163免疫熒光分析

熒光的猝滅：熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長(zhǎng)時(shí)間的照射后會(huì)減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài),，所吸收的能量無(wú)法以熒光的形式發(fā)射,。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光,。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸,。在熒光抗體技術(shù)中常用一些非熒的色素物質(zhì)如亞甲藍(lán)、堿性復(fù)紅,。伊文思藍(lán)或低濃度的過(guò)錳酸鉀,、碘溶液等對(duì)標(biāo)本進(jìn)行得當(dāng)復(fù)染，以減弱非特異性熒光本質(zhì),，使特異熒光更突出顯示,。CD163免疫熒光分析

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