免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種,。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù),。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位,。免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù),。Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記抗體獲得成功。經(jīng)過幾十年的發(fā)展,，該技術(shù)已相當(dāng)成熟,。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法,。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù),。在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣將熒光抗體技術(shù)稱為免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)可以用于研究環(huán)境污染和毒物作用,。COL-1免疫熒光

細(xì)胞的固定及免疫熒光：注意事項：（1）取細(xì)胞爬片時,，動作應(yīng)輕柔，防止將細(xì)胞爬片夾碎,，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程,。（2）種細(xì)胞過程中，要注意將細(xì)胞輕柔混勻,，“八”字或者“十”字形搖晃,，防止細(xì)胞局部生長過密。（3）稀釋,、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光,。（4）細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后，需要盡快拍照,，防止免疫熒光淬滅,。或者放于暗盒內(nèi),，暫時保存于4度冰箱,，盡快拍照。（5）在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時,，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源,。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光,。nestin免疫組化IHC免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫相關(guān)疾病和自身免疫病,。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項：為了保證熒光染色的正確性，初次試驗(yàn)時需設(shè)置下述對照,，以排除某些非特異性熒光染色的干擾,。①標(biāo)本自發(fā)熒光對照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS,。②特異性對照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體,，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。③陽性對照：已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體,。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光,，陽性對照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光,，則為特異性陽性染色。一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min,，就有熒光減弱現(xiàn)象,，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本較好在當(dāng)天觀察，隨著時間的延長,，熒光強(qiáng)度會逐漸下降,。

細(xì)胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是利用免疫技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合,，原理就是利用抗原-抗體反應(yīng)之后,，采用熒光標(biāo)記，標(biāo)記完成后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)某種抗原成分的多少,，從而做出一個定位研究，也可以為細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)提供一個明確的指導(dǎo),，細(xì)胞免疫熒光具有敏感性強(qiáng),、特異性高、速度快的特點(diǎn),，是目前比較常用的組織學(xué)技術(shù),，也是比較精確的。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來顯示目的蛋白,，主要包括蛋白和一抗結(jié)合,，其次是帶有熒光基團(tuán)的二抗識別并結(jié)合一抗，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞信號傳導(dǎo)和信號通路,。

熒光色素：四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長為550nm,，較大發(fā)射光波長為620nm,，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明,，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低,。免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù),，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù),。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位和表達(dá)水平,。alpha 1 Fetoprotein免疫抗體

免疫熒光技術(shù)通過熒光信號的觀察來確定抗原或抗體的分布和定位。COL-1免疫熒光

免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團(tuán)在一定波長（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性,，經(jīng)過短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長發(fā)射光子,，并伴隨能量損失。發(fā)射的熒光可通過顯微鏡觀察到,。熒光團(tuán)可以通過可見光或紫外光激發(fā),。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場上購買，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長范圍,。它們不會損傷活細(xì)胞,，可安全用于生物制劑。在進(jìn)行免疫熒光檢測時,，首先對細(xì)胞或組織進(jìn)行固定和透化處理,。進(jìn)行免疫染色時，熒光團(tuán)與目標(biāo)抗原的抗體結(jié)合,，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號,。根據(jù)使用的抗體和所需的信號擴(kuò)增，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型,。COL-1免疫熒光

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