其他熒光物質(zhì)：1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì),。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm,，發(fā)射光波長為450nm,。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。2．鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3+）,、鋱（Tb3+）,、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3+應(yīng)用較廣,。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬,，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長,，較適合用于分辨熒光免疫測定,。所需要的儀器：熒光顯微鏡、顯微熒光分光光度計,、流式細(xì)胞儀和時間分辨熒光計等儀器激光共聚焦顯微鏡,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。PD-L1免疫熒光染色

細(xì)胞的固定及免疫熒光：吸去一抗,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗,，37℃,，室溫避光孵育1小時。注意二抗帶有熒光素標(biāo)記,，因此操作過程盡量在暗處進(jìn)行,。吸去二抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min,。向玻片上滴加DAPI,，或者Hoechst復(fù)染細(xì)胞核，一般為藍(lán)色熒光,；避光孵育5-10min,。使用PBS輕洗細(xì)胞3 次，每次 5 min,，洗去多余的DAPI,。取爬片時由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊，張力較大,，可將注射器針頭針尖向背面做個小鉤,，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出即可,。用吸水紙吸干爬片上的液體,，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，注意將爬片反過來貼于多聚賴氨酸載玻片上,，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,，注意選擇抗體對應(yīng)的激發(fā)光源。CD86免疫熒光免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附,。

免疫熒光實驗步驟：1.樣本準(zhǔn)備：細(xì)胞或薄組織,。對單層生長細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時,，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片,，PBS洗兩次,；對懸浮生長細(xì)胞，取對數(shù)生長細(xì)胞,，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次,，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。2.固定：取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過夜,。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次,。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本,，目的是使抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合。

細(xì)胞免疫熒光可以觀察蛋白在細(xì)胞中的定位,，以及一些特殊信號分子蛋白的出核/入核的定位變化,。在進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光過程中，需要用到細(xì)胞爬片，通過將爬片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi),，細(xì)胞在爬片上生長,，進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光。實驗前準(zhǔn)備：1.胰酶;2.DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基;3.細(xì)胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片,。間接免疫熒光的優(yōu)點：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號放大,；與直接免疫熒光相比，通過信號放大提高檢測靈敏度,。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù),。免疫熒光技術(shù)可以用于研究內(nèi)臟移植和免疫抑制。

熒光素標(biāo)記抗體的方法：方法及步驟：①抗體的準(zhǔn)備：取適量已知球蛋白濃度之溶液,，置入三角燒瓶中,，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使然后蛋白濃度為20mg/ml,，緩沖液容量為總量的1/10,，混勻，將三角燒瓶置冰槽中,，電磁攪拌（速度適當(dāng)以不起泡沫為宜）5～10min,。②熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素,，用分析天平準(zhǔn)確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末,。③結(jié)合（或稱標(biāo)記）：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內(nèi)加完）,，加畢后,，繼續(xù)攪拌12～18h。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右,，故須及時添冰去水,；亦可將結(jié)合裝置安放在4℃冰箱或冰庫中。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期,。Brdu免疫

在1941年,，Coons初次成功地使用熒光素作為標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行免疫熒光實驗。PD-L1免疫熒光染色

熒光的猝滅：熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅,，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài),，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑,，以消除不需用的熒光,。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術(shù)中常用一些非熒的色素物質(zhì)如亞甲藍(lán),、堿性復(fù)紅,。伊文思藍(lán)或低濃度的過錳酸鉀,、碘溶液等對標(biāo)本進(jìn)行得當(dāng)復(fù)染，以減弱非特異性熒光本質(zhì),，使特異熒光更突出顯示,。PD-L1免疫熒光染色

上海睿寶和生物科技有限公司在同行業(yè)領(lǐng)域中，一直處在一個不斷銳意進(jìn)取,，不斷制造創(chuàng)新的市場高度,，多年以來致力于發(fā)展富有創(chuàng)新價值理念的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，在上海市等地區(qū)的商務(wù)服務(wù)中始終保持良好的商業(yè)口碑,，成績讓我們喜悅,，但不會讓我們止步，殘酷的市場磨煉了我們堅強(qiáng)不屈的意志,，和諧溫馨的工作環(huán)境,，富有營養(yǎng)的公司土壤滋養(yǎng)著我們不斷開拓創(chuàng)新，勇于進(jìn)取的無限潛力,，上海睿寶和生物科技供應(yīng)攜手大家一起走向共同輝煌的未來,，回首過去，我們不會因為取得了一點點成績而沾沾自喜,，相反的是面對競爭越來越激烈的市場氛圍,，我們更要明確自己的不足，做好迎接新挑戰(zhàn)的準(zhǔn)備,，要不畏困難,，激流勇進(jìn)，以一個更嶄新的精神面貌迎接大家,，共同走向輝煌回來,！