其他熒光物質(zhì)：1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質(zhì),。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm,，發(fā)射光波長為450nm,。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。2．鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3+）,、鋱（Tb3+）,、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3+應用較廣,。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬,，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長,，較適合用于分辨熒光免疫測定,。所需要的儀器：熒光顯微鏡、顯微熒光分光光度計,、流式細胞儀和時間分辨熒光計等儀器激光共聚焦顯微鏡,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。PD-L1免疫熒光染色

細胞的固定及免疫熒光：吸去一抗,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗,，37℃，室溫避光孵育1小時,。注意二抗帶有熒光素標記,，因此操作過程盡量在暗處進行。吸去二抗,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min。向玻片上滴加DAPI,，或者Hoechst復染細胞核,，一般為藍色熒光；避光孵育5-10min,。使用PBS輕洗細胞3 次,，每次 5 min，洗去多余的DAPI,。取爬片時由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊,，張力較大，可將注射器針頭針尖向背面做個小鉤，這樣將爬片輕輕勾起,，用小鑷子取出即可,。用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,，注意將爬片反過來貼于多聚賴氨酸載玻片上,，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，注意選擇抗體對應的激發(fā)光源,。CD86免疫熒光免疫熒光技術(shù)可以用于研究細胞遷移和細胞黏附,。

免疫熒光實驗步驟：1.樣本準備：細胞或薄組織。對單層生長細胞,，在傳代培養(yǎng)時,，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片,，PBS洗兩次,；對懸浮生長細胞，取對數(shù)生長細胞,，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次,，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。2.固定：取適當?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過夜,。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次,。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本,，目的是使抗體更容易進入細胞與抗原結(jié)合。

細胞免疫熒光可以觀察蛋白在細胞中的定位,，以及一些特殊信號分子蛋白的出核/入核的定位變化,。在進行細胞免疫熒光過程中，需要用到細胞爬片,，通過將爬片浸在細胞培養(yǎng)基內(nèi),，細胞在爬片上生長，進而進行細胞的免疫熒光,。實驗前準備：1.胰酶;2.DMEM細胞培養(yǎng)基;3.細胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片,。間接免疫熒光的優(yōu)點：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進行信號放大；與直接免疫熒光相比,，通過信號放大提高檢測靈敏度,。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達的標記免疫技術(shù)。免疫熒光技術(shù)可以用于研究內(nèi)臟移植和免疫抑制,。

熒光素標記抗體的方法：方法及步驟：①抗體的準備：取適量已知球蛋白濃度之溶液,，置入三角燒瓶中，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使然后蛋白濃度為20mg/ml,，緩沖液容量為總量的1/10,，混勻，將三角燒瓶置冰槽中,，電磁攪拌（速度適當以不起泡沫為宜）5～10min,。②熒光素的準備：根據(jù)欲標記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素,，用分析天平準確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末,。③結(jié)合（或稱標記）：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內(nèi)加完）,，加畢后,，繼續(xù)攪拌12～18h。結(jié)合期間應保持蛋白溶液于4℃左右,，故須及時添冰去水,；亦可將結(jié)合裝置安放在4℃冰箱或冰庫中。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細胞分裂和細胞周期,。Brdu免疫

在1941年,，Coons初次成功地使用熒光素作為標記物質(zhì)進行免疫熒光實驗。PD-L1免疫熒光染色

熒光的猝滅：熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅,，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復到基態(tài),，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑,，以消除不需用的熒光,。因此熒光物質(zhì)的保存應注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術(shù)中常用一些非熒的色素物質(zhì)如亞甲藍,、堿性復紅,。伊文思藍或低濃度的過錳酸鉀、碘溶液等對標本進行得當復染,，以減弱非特異性熒光本質(zhì)，使特異熒光更突出顯示,。PD-L1免疫熒光染色

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