熒光效率：熒光分子不會將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光,，總或多或少地以其他形式釋放,。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比,。熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強度）／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強度）,。發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強度,，除受激發(fā)光強度影響外，也與激發(fā)光的波長有關(guān),。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜）,，即在某一特定波長處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的較大吸收峰波長,，且測定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時,，得到的熒光強度也較大。免疫熒光在醫(yī)學(xué)診斷中起著重要作用,，可以用于檢測病原體,、肉瘤標(biāo)志物等。COX2免疫檢測

免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng),。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時，只要知道其中的一個因素,，就可以查出另一個因素,。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后,，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng),。在此基礎(chǔ)上又分為兩種方法：直接法和間接法。直接法：將標(biāo)記的特異性熒光抗體直接加到抗原上,，經(jīng)過一定時間反應(yīng),，即可結(jié)合并顯色。間接法：先用抗原的抗體（一抗）與抗原反應(yīng)結(jié)合,，再用熒光標(biāo)記的二抗（一抗的抗體）與抗原反應(yīng)，形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物,。CRT(Calreticulin)免疫熒光試驗免疫熒光技術(shù)可以用于研究藥物的靶點和作用機制,。

免疫熒光通透（目的是使抗體進入胞內(nèi)），0.5%TritonX-100(一種去垢劑,，用PBS配制)室溫通透20min（針對胞內(nèi)抗原,，若是細胞膜上表達的抗原則省略該步驟）；除了TritonX-100,，也可作為通透劑,，并且固定后的樣品不需要通透。封閉（減少一抗和二抗與非特異位點進行結(jié)合）,，通透后用PBS浸洗玻片3次,，每次3min，吸水紙吸干PBS,，在玻片上滴加山羊血清,，室溫封閉30min,。常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清、BSA或者是羊血清,。從封閉開始所有的步驟,，一定要注意樣品的保濕，避免樣品的干燥,，否則極易產(chǎn)生較高的背景,。醛類固定的樣品，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進行封閉,。

細胞免疫熒光實驗注意事項：根據(jù)所檢測抗原所在位置來確認(rèn)是否需要加入 Triton 進行通透,。若所檢測抗原表位位于膜蛋白的白外段，則不需要通透,；一般 5% BSA 封閉即可達到效果,；從加熒光二抗起，后面所有操作步驟盡量避光,?？s短在熒光顯微鏡下的觀察時間，1~2 h 為宜,。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察,，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。無/弱染色：烤片溫度過高,，推薦 56~60 ℃ 1~2 h,；一抗是否適用固定液和石蠟切片，使用濃度是否過低,，孵育是否時間過短等,。在實際工作中，熒光抗原技術(shù)應(yīng)用較少,，因此通常將其稱為熒光抗體技術(shù)或免疫熒光技術(shù),。

其他熒光物質(zhì)：酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質(zhì),。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm,，發(fā)射光波長為450nm,。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3）,、鋱（Tb3）,、鈰（Ce3）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3應(yīng)用較廣,。Eu3螯合物的激發(fā)光波長范圍寬,，發(fā)射光波長范圍窄,，熒光衰變時間長，較適合用于分辨熒光免疫測定,。免疫熒光技術(shù)可以通過熒光顯微鏡觀察樣品中的熒光信號,，從而確定目標(biāo)分子的存在和位置。Desmin免疫熒光染色

免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫系統(tǒng)的功能和異常,。COX2免疫檢測

熒光抗體技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)后,，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法。免疫熒光測定：抗原抗體反應(yīng)后,，利用特殊儀器測定熒光強度而推算被測物濃度的檢測方法,。免疫熒光實驗步驟：直接法測抗原：基本原理：將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng),。其優(yōu)點是方法簡便,、特異性高，非特異性熒光染色少,。缺點是敏感性偏低,；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細菌,、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢,、皮膚活檢的免疫病理檢查。COX2免疫檢測

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