細(xì)胞免疫熒光：細(xì)胞種板與細(xì)胞爬片制備：1) 細(xì)胞密度在90%-95%左右,，用預(yù)熱胰酶消化細(xì)胞后重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中,，充分吹打，使之成單細(xì)胞懸液,，計(jì)數(shù),。2)取細(xì)胞培養(yǎng)12孔板，在每個(gè)孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小,，先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基,，然后將爬片置于液滴上，壓緊,，使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,，防止加細(xì)胞懸液時(shí)爬片漂起，造成雙層細(xì)胞貼片,。根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi),。3)24h或者48h后，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度快慢,，觀察判斷細(xì)胞密度,，約90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光。免疫熒光技術(shù)可以用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病,。JNK免疫熒光檢查

細(xì)胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是利用免疫技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，原理就是利用抗原-抗體反應(yīng)之后,，采用熒光標(biāo)記,，標(biāo)記完成后，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)某種抗原成分的多少,，從而做出一個(gè)定位研究,，也可以為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)提供一個(gè)明確的指導(dǎo)，細(xì)胞免疫熒光具有敏感性強(qiáng),、特異性高,、速度快的特點(diǎn)，是目前比較常用的組織學(xué)技術(shù),，也是比較精確的,。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來顯示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗結(jié)合,，其次是帶有熒光基團(tuán)的二抗識(shí)別并結(jié)合一抗,，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光。S100A4免疫熒光染色免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫相關(guān)疾病和自身免疫病,。

免疫熒光間接法測(cè)抗體實(shí)驗(yàn)步驟：滴加0.01mol/L,，pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片，10min后棄去,，使標(biāo)本片保持一定濕度,。滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本,，覆蓋已知抗原標(biāo)本片,。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min,。取出玻片,，置于玻片架上,，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次,，然后按順序過0.01mol/L,，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min,，不時(shí)振蕩,。取出玻片，用濾紙吸去多余水分,，但不使標(biāo)本干燥,，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi),，37℃保溫30min,。重復(fù)操作3。取出玻片,，用濾紙吸去多余水分,，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片,。熒光顯微鏡高倍視野下觀察,，結(jié)果判定同直接法。

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過氧化物酶,；孵育過程中干片,；抗原熱修復(fù)過度。染色過深：一抗?jié)舛冗^高,；染色試濃度過高或孵育時(shí)間過長(zhǎng),；染色劑濃度過高或孵育時(shí)間過長(zhǎng)。通常實(shí)驗(yàn)室先固定細(xì)胞再進(jìn)行通透,，但若檢測(cè)抗原是水不溶性蛋白,，可先通透再固定，這樣可以通過通透去除一些水溶性蛋白,，進(jìn)而可降低免疫熒光背景和非特異性信號(hào),；建議設(shè)陰性對(duì)照組，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色,；選擇醛類固定液時(shí),，保持其新鮮度，較好現(xiàn)配現(xiàn)用,，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會(huì)升高,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期。

細(xì)胞免疫熒光簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7,、2-7,、4 37度 PBS 2小時(shí),。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘,。3. PBS洗凈：3min×3,。4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS,。5. PBS洗凈：2×5 min。6. 羊血清封閉：37度,，20分鐘,。7. 一抗，4度過夜,，一般要大于18小時(shí)或者37度,，1-2小時(shí)。8. 4度PBS洗凈,，3 min×5次,。9. 二抗37度小于一小時(shí)。10. 37度 PBS洗凈,，3×5 min,。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）；不管采用何種方法,，在使用PBS緩沖液漂洗時(shí),，都要漂洗干凈并且要測(cè)下pH值，可以使用PBS多清洗幾次,，也可以延長(zhǎng)PBS清洗時(shí)間,，如果結(jié)果背景較高可以延長(zhǎng)漂洗的次數(shù)和時(shí)。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和信號(hào)通路,。CD163免疫熒光分析

免疫熒光技術(shù)可以用于研究動(dòng)物模型和藥物篩選,。JNK免疫熒光檢查

免疫熒光注意事項(xiàng)：對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置：1、內(nèi)源性組織背景對(duì)照：某些細(xì)胞和組織可能有固有的生物學(xué)性質(zhì),，會(huì)產(chǎn)生背景熒光,，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，例如色素脂褐質(zhì),。因此在孵育一抗前,，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行觀察，確?？乖旧頉]有信號(hào),。2、陽(yáng)性對(duì)照：用確認(rèn)含有待測(cè)抗原的組織或細(xì)胞,，與待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)一處理,，結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性,，可證明待測(cè)抗原有一定活性并且實(shí)驗(yàn)過程中用的試劑及方法均可靠。3,、陰性對(duì)照：與陽(yáng)性對(duì)照相反,，用明確不含有待測(cè)抗原的細(xì)胞或組織切片染色，結(jié)果若為陰性,，可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽(yáng)性結(jié)果,。JNK免疫熒光檢查

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