細胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基，一般先加入PBS浸洗細胞 3 次,，每次 5 min。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml,，進行細胞固定,，室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min,，目的是使細胞通透,。5) 除去Triton X-100,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時（選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致）,。封閉后不需要用PBS清洗,。7)吸去封閉液,，向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗（一次使用抗體可以根據(jù)抗體說明書推薦濃度，后續(xù)實驗可以摸索抗體的適宜濃度）,，4℃濕盒內(nèi)孵育過夜,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的亞細胞定位。AIRE-1免疫熒光

細胞免疫熒光步驟是什么呢,？步驟：1. 細胞一定要貼在玻片上（較好可以放入24孔板）,，為后面照像打基礎(chǔ)。細胞密度適中,，大約60-75%滿片即可,，否則容易脫片。2. 取出細胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘,，現(xiàn)用現(xiàn)配,。（以下各步驟切毋使玻片干燥）3. PBS沖洗；4. 0.1%Triton作用20分鐘,；5. PBS沖洗,；6. 10%正常血清封閉10分鐘；7. 加入一抗,，4度孵育過夜（找個小瓶蓋將小玻片支起來,，抗體就不容易溢出），還要記住“砸片”,，就是抗體從較高處落到片子上,，以分布均勻?？贵w稀釋度1：60,，較常用！8. PBS沖洗4次,，各5分鐘,；9加入熒光二抗，室溫30分鐘,?？贵w稀釋度1：400，較常用,！10. 90%甘油封片,。也很關(guān)鍵阿，多封幾次才有體會,。12. 避光保存,，或到顯微鏡下觀察。HBCAg免疫熒光分析免疫熒光是一種常用的生物學實驗技術(shù),，用于檢測和定位特定抗原或抗體,。

免疫熒光實驗的注意事項：為了保證熒光染色的正確性,，初次試驗時需設(shè)置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾,。①標本自發(fā)熒光對照：標本加1-2滴0.01mol/L,，pH7.4的PBS。②特異性對照（抑制試驗）：標本加未標記的特異性抗體,，再加熒光標記的特異性抗體,。③陽性對照：已知的陽性標本加熒光標記的特異性抗體。如果標本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光,，陽性對照和待檢標本呈強熒光,，則為特異性陽性染色。一般標本在高壓汞燈下照射超過3min,，就有熒光減弱現(xiàn)象,，經(jīng)熒光染色的標本較好在當天觀察，隨著時間的延長,，熒光強度會逐漸下降,。

免疫熒光注意事項：對照實驗的設(shè)置：1、內(nèi)源性組織背景對照：某些細胞和組織可能有固有的生物學性質(zhì),，會產(chǎn)生背景熒光,，對結(jié)果產(chǎn)生影響，例如色素脂褐質(zhì),。因此在孵育一抗前,，應(yīng)對樣品進行觀察，確?？乖旧頉]有信號,。2、陽性對照：用確認含有待測抗原的組織或細胞,，與待測標本進行統(tǒng)一處理,，結(jié)果應(yīng)為陽性，可證明待測抗原有一定活性并且實驗過程中用的試劑及方法均可靠,。3,、陰性對照：與陽性對照相反，用明確不含有待測抗原的細胞或組織切片染色,，結(jié)果若為陰性,，可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性結(jié)果。免疫熒光技術(shù)可以用于研究內(nèi)臟移植和免疫抑制,。

免疫熒光間接法測抗體實驗注意事項：1）熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,，或于4℃保存4h，時間過長,，會使熒光減弱,。2）每次試驗時，需設(shè)置以下三種對照：①陽性對照：陽性血清+熒光標記物②陰性對照：陰性血清+熒光標記物③熒光標記物對照：PBS+熒光標記物3.已知抗原標本片需在操作的各個步驟中,，始終保持濕潤,，避免干燥。4.所滴加的待檢抗體標本或熒光標記物,，應(yīng)始終保持在已知抗原標本片上,，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究代謝疾病和內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能,。SIRT7免疫

早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，用于定位組織或細胞內(nèi)的抗原物質(zhì),。AIRE-1免疫熒光

注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行.DAPI復染核:爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液,，避光室溫孵育10min,。封片：爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。玻片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片,。鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm,，發(fā)射波長420nm,，發(fā)藍光；FITC激發(fā)波長465-495nm,，發(fā)射波長515-555nm,，發(fā)綠光；CY3激發(fā)波長510-560,，發(fā)射波長590nm,，發(fā)紅光）。兩種抗體同時孵育：由于FIT容易萃滅,，因此在孵育抗體時后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光,。AIRE-1免疫熒光

上海睿寶和生物科技有限公司是一家集生產(chǎn)科研、加工,、銷售為一體的****,，公司成立于2018-12-11，位于上海市閔行區(qū)都莊路2350號2幢201室,。公司誠實守信,，真誠為客戶提供服務(wù)。公司主要經(jīng)營病理檢測服務(wù),，免疫組化檢測服務(wù),，分子檢測服務(wù),，全景掃描服務(wù)，公司與病理檢測服務(wù),，免疫組化檢測服務(wù),，分子檢測服務(wù)，全景掃描服務(wù)行業(yè)內(nèi)多家研究中心,、機構(gòu)保持合作關(guān)系,，共同交流、探討技術(shù)更新,。通過科學管理,、產(chǎn)品研發(fā)來提高公司競爭力。公司與行業(yè)上下游之間建立了長久親密的合作關(guān)系,，確保病理檢測服務(wù),，免疫組化檢測服務(wù)，分子檢測服務(wù),，全景掃描服務(wù)在技術(shù)上與行業(yè)內(nèi)保持同步,。產(chǎn)品質(zhì)量按照行業(yè)標準進行研發(fā)生產(chǎn)，絕不因價格而放棄質(zhì)量和聲譽,。睿寶和秉承著誠信服務(wù),、產(chǎn)品求新的經(jīng)營原則，對于員工素質(zhì)有嚴格的把控和要求,，為病理檢測服務(wù),，免疫組化檢測服務(wù)，分子檢測服務(wù),，全景掃描服務(wù)行業(yè)用戶提供完善的售前和售后服務(wù),。