熒光效率：熒光分子不會(huì)將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光,，總或多或少地以其他形式釋放,。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強(qiáng)度）／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）,。發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度，除受激發(fā)光強(qiáng)度影響外,，也與激發(fā)光的波長(zhǎng)有關(guān),。各個(gè)熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜），即在某一特定波長(zhǎng)處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰,。選擇激發(fā)光波長(zhǎng)量接近于熒光分子的較大吸收峰波長(zhǎng),，且測(cè)定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時(shí)，得到的熒光強(qiáng)度也較大,。免疫熒光是一種常用的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),，用于檢測(cè)和定位特定抗原或抗體。CD68免疫組化IHC

免疫熒光-實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞爬片免疫熒光：在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;（圓蓋片：13mm24孔,；18mm12孔,；20mm6孔）用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA（PBS配置）,室溫封閉30min5,吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量用PBS稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜。加熒光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中室溫孵育50min,。CK14免疫組化免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡,、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化等生物學(xué)過程。

免疫熒光技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng),、敏感性高,、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問題尚未完全解決,，結(jié)果判定的客觀性不足,，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可進(jìn)一步分做若干種,。與放射免疫法相比,，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡(jiǎn)便,，便于推廣,。國(guó)外生產(chǎn)的TDM用試劑盒，有相當(dāng)一部分即屬于此類,，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生產(chǎn),。由于一般熒光測(cè)定中的本底較高等問題，熒光免疫技術(shù)用于定量測(cè)定有一定困難,。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測(cè)定,，與酶免疫測(cè)定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用,。

zo-1的免疫熒光,，步驟如下：1.細(xì)胞在蓋片上生長(zhǎng)融合到95%-100%時(shí)，從孵箱中取出,。2.用預(yù)溫的1×PBS洗3次,，每次10分鐘。3.4%的甲醛室溫固定20-30分鐘,。4.1×PBS洗3次,，每次10分鐘。5.0.2%TritonX-100透化2-5分鐘,。6.1×PBS洗3次,，每次10分鐘。7.5%BSA室溫封閉30分鐘,。8.加一抗（用1%BSA稀釋）放在濕盒里,，4度過夜。9.1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。10.加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘，閉光,。11.1×PBS洗3次,，每次10分鐘。12.95%甘油封片,。注：4%甲醛,，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀釋,。早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，用于定位組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原物質(zhì)。

免疫熒光通透（目的是使抗體進(jìn)入胞內(nèi)）,，0.5%TritonX-100(一種去垢劑,，用PBS配制)室溫通透20min（針對(duì)胞內(nèi)抗原，若是細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原則省略該步驟）,；除了TritonX-100,，也可作為通透劑，并且固定后的樣品不需要通透,。封閉（減少一抗和二抗與非特異位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合）,，通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3min,，吸水紙吸干PBS,，在玻片上滴加山羊血清，室溫封閉30min,。常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清,、BSA或者是羊血清。從封閉開始所有的步驟,，一定要注意樣品的保濕,，避免樣品的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景,。醛類固定的樣品,，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進(jìn)行封閉。免疫熒光技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中具有普遍的應(yīng)用前景,。AR免疫

免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位和表達(dá)水平,。CD68免疫組化IHC

熒光物質(zhì)，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象,，但并非都可用作熒光色素,。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,，易溶于水或酒精等溶劑,。分子量為389.4，較大吸收光波長(zhǎng)為490--495nm,，較大發(fā)射光波長(zhǎng)520--530nm,，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu),，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率,、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,，在冷暗干燥處可保存多年,，是應(yīng)用較普遍的熒光素,。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色,。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末,，不溶于水，易溶于酒精,。性質(zhì)穩(wěn)定,，可長(zhǎng)期保存。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長(zhǎng)為570nm,，較大發(fā)射光波長(zhǎng)為595～600nm,，呈橘紅色熒光。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長(zhǎng)為550nm,，較大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm,，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明,，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低,。CD68免疫組化IHC

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