細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題:1,、信號(hào)弱或者無(wú)信號(hào)：細(xì)胞或組織樣本保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng),；2）抗體濃度不合適，參照抗體說(shuō)明書(shū)的稀釋濃度,，再根據(jù)樣本表達(dá)量進(jìn)行摸索,；3）一抗孵育時(shí)間不合適，建議 4 ℃ 過(guò)夜孵育,。2,、高背景：封閉不充分；抗體濃度過(guò)高,；抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度過(guò)高,；清洗不充分；樣本變干,，染色過(guò)程確保樣品始終浸沒(méi)于液體環(huán)境中.3,、非特異性染色較多：固定液殘留,，這里需要縮短固定時(shí)間并且在封閉液中加甘氨酸，并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色,；二抗殘留,，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解，只要熒光顯微鏡的強(qiáng)度還可以增大,，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究代謝疾病和內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能。VEGFR2免疫抗體

細(xì)胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是利用免疫技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合,，原理就是利用抗原-抗體反應(yīng)之后，采用熒光標(biāo)記,，標(biāo)記完成后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)某種抗原成分的多少，從而做出一個(gè)定位研究,，也可以為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)提供一個(gè)明確的指導(dǎo),，細(xì)胞免疫熒光具有敏感性強(qiáng)、特異性高,、速度快的特點(diǎn),，是目前比較常用的組織學(xué)技術(shù)，也是比較精確的,。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來(lái)顯示目的蛋白,，主要包括蛋白和一抗結(jié)合，其次是帶有熒光基團(tuán)的二抗識(shí)別并結(jié)合一抗,，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光,。VEGFR2免疫抗體免疫熒光技術(shù)可以用于研究環(huán)境污染和毒物作用。

細(xì)胞的固定及免疫熒光：吸去一抗,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗,，37℃,，室溫避光孵育1小時(shí)。注意二抗帶有熒光素標(biāo)記,，因此操作過(guò)程盡量在暗處進(jìn)行,。吸去二抗，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min,。向玻片上滴加DAPI，或者Hoechst復(fù)染細(xì)胞核，一般為藍(lán)色熒光,；避光孵育5-10min,。使用PBS輕洗細(xì)胞3 次，每次 5 min,，洗去多余的DAPI,。取爬片時(shí)由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊，張力較大,，可將注射器針頭針尖向背面做個(gè)小鉤,，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出即可,。用吸水紙吸干爬片上的液體,，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，注意將爬片反過(guò)來(lái)貼于多聚賴氨酸載玻片上,，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,，注意選擇抗體對(duì)應(yīng)的激發(fā)光源。

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1,、建議細(xì)胞直接種孔板,，采用倒置熒光顯微鏡拍照，這樣可以避免然后挑片時(shí)造成劃片或細(xì)胞片破損以及然后封片可能造成滑片等結(jié)果,；2,、若實(shí)驗(yàn)室只有正置熒光顯微鏡，則需要將細(xì)胞植于細(xì)胞爬片,。建議直接購(gòu)買(mǎi)處理過(guò)的細(xì)胞爬片,；若只有普通細(xì)胞爬片，可以先將爬片于濃酸（濃酸腐蝕性強(qiáng),，注意操作）或 75% 乙醇浸泡過(guò)夜,，若用酸浸泡過(guò)夜，第二天先用自來(lái)水小心沖洗掉爬片殘留的酸液,，若用 75% 乙醇浸泡，則不需要此步驟,。然后,，用洗潔精搓洗爬片，然后用去離子水清洗爬片,。置于烘箱 80 ℃ 烘干,，再將爬片置于超凈臺(tái)造紫外消毒后備用。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡和細(xì)胞存活,。

免疫熒光的制作：樣品準(zhǔn)備（貼壁細(xì)胞,、懸浮細(xì)胞以及組織等）：對(duì)于貼壁細(xì)胞：先將潔凈的蓋玻片在70%乙醇中進(jìn)行浸泡處理，然后用干凈無(wú)菌的鑷子放置到培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌PBS洗去殘留的乙醇,。待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片,，操作小心，防止細(xì)胞脫片,。對(duì)于懸浮細(xì)胞：有2種方法,，①先在懸浮液中進(jìn)行固定步驟，然后把細(xì)胞滴加在載玻片上,，干燥后細(xì)胞會(huì)緊貼在載玻片上,。②先在懸浮液中進(jìn)行固定和染色步驟，離心洗脫,，然后用移液管移至盒式玻片進(jìn)行后續(xù)染色步驟,。對(duì)于冷凍切片：切片放置在載玻片上后，可以直接進(jìn)行固定等后續(xù)操作,。對(duì)于石蠟切片：免疫熒光中石蠟切片較少,，要先進(jìn)行脫蠟和抗原修復(fù)處理。免疫熒光技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中具有普遍的應(yīng)用前景,。VEGFR2免疫抗體

免疫熒光技術(shù)是基于免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的重要方法之一。VEGFR2免疫抗體

細(xì)胞免疫熒光步驟是什么呢,？步驟：1. 細(xì)胞一定要貼在玻片上（較好可以放入24孔板）,，為后面照像打基礎(chǔ)。細(xì)胞密度適中,，大約60-75%滿片即可,，否則容易脫片。2. 取出細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘,，現(xiàn)用現(xiàn)配,。（以下各步驟切毋使玻片干燥）3. PBS沖洗；4. 0.1%Triton作用20分鐘,；5. PBS沖洗,；6. 10%正常血清封閉10分鐘；7. 加入一抗,，4度孵育過(guò)夜（找個(gè)小瓶蓋將小玻片支起來(lái),，抗體就不容易溢出），還要記住“砸片”,，就是抗體從較高處落到片子上,，以分布均勻?？贵w稀釋度1：60,，較常用！8. PBS沖洗4次，各5分鐘,；9加入熒光二抗,，室溫30分鐘?？贵w稀釋度1：400,，較常用！10. 90%甘油封片,。也很關(guān)鍵阿,，多封幾次才有體會(huì)。12. 避光保存,，或到顯微鏡下觀察,。VEGFR2免疫抗體

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