zo-1的免疫熒光，步驟如下：1.細(xì)胞在蓋片上生長(zhǎng)融合到95%-100%時(shí),，從孵箱中取出,。2.用預(yù)溫的1×PBS洗3次,，每次10分鐘。3.4%的甲醛室溫固定20-30分鐘,。4.1×PBS洗3次,，每次10分鐘。5.0.2%TritonX-100透化2-5分鐘,。6.1×PBS洗3次,，每次10分鐘。7.5%BSA室溫封閉30分鐘,。8.加一抗（用1%BSA稀釋?zhuān)┓旁跐窈欣铮?度過(guò)夜,。9.1×PBS洗3次，每次10分鐘,。10.加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘,，閉光。11.1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。12.95%甘油封片。注：4%甲醛,，0.2%Triton,，5%BSA均用1×PBS稀釋,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。P21免疫抗體

熒光效率：熒光分子不會(huì)將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光,，總或多或少地以其他形式釋放,。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比,。熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強(qiáng)度）／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）,。發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度，除受激發(fā)光強(qiáng)度影響外,，也與激發(fā)光的波長(zhǎng)有關(guān),。各個(gè)熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜），即在某一特定波長(zhǎng)處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰,。選擇激發(fā)光波長(zhǎng)量接近于熒光分子的較大吸收峰波長(zhǎng),，且測(cè)定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時(shí)，得到的熒光強(qiáng)度也較大,。P21免疫抗體免疫熒光技術(shù)是一種利用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原的技術(shù),。

免疫熒光注意事項(xiàng)：對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置：1、內(nèi)源性組織背景對(duì)照：某些細(xì)胞和組織可能有固有的生物學(xué)性質(zhì),，會(huì)產(chǎn)生背景熒光,，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，例如色素脂褐質(zhì),。因此在孵育一抗前,，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行觀察，確?？乖旧頉](méi)有信號(hào),。2、陽(yáng)性對(duì)照：用確認(rèn)含有待測(cè)抗原的組織或細(xì)胞,，與待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)一處理,，結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性,，可證明待測(cè)抗原有一定活性并且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用的試劑及方法均可靠,。3、陰性對(duì)照：與陽(yáng)性對(duì)照相反,，用明確不含有待測(cè)抗原的細(xì)胞或組織切片染色,，結(jié)果若為陰性，可排除染色過(guò)程中由于非特異性染色造成的假陽(yáng)性結(jié)果,。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)：為了保證熒光染色的正確性,，初次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾,。①標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L,，pH7.4的PBS。②特異性對(duì)照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體,。③陽(yáng)性對(duì)照：已知的陽(yáng)性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體,。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無(wú)熒光或弱熒光，陽(yáng)性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光,，則為特異性陽(yáng)性染色,。一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過(guò)3min，就有熒光減弱現(xiàn)象,，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本較好在當(dāng)天觀察,，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程,。

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；孵育過(guò)程中干片,；抗原熱修復(fù)過(guò)度,。染色過(guò)深：一抗?jié)舛冗^(guò)高；染色試濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng),；染色劑濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng),。通常實(shí)驗(yàn)室先固定細(xì)胞再進(jìn)行通透，但若檢測(cè)抗原是水不溶性蛋白,，可先通透再固定,，這樣可以通過(guò)通透去除一些水溶性蛋白，進(jìn)而可降低免疫熒光背景和非特異性信號(hào),；建議設(shè)陰性對(duì)照組,，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色；選擇醛類(lèi)固定液時(shí),，保持其新鮮度,，較好現(xiàn)配現(xiàn)用，使用不新鮮的醛類(lèi)固定液自發(fā)熒光背景會(huì)升高,。免疫熒光是一種常用的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),，用于檢測(cè)和定位特定抗原或抗體。HBSAg免疫組化IHC

在1941年,，Coons初次成功地使用熒光素作為標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn),。P21免疫抗體

熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測(cè)相比,，成本較低,。間接免疫熒光的缺點(diǎn)：由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體，因此物種交叉反應(yīng)性問(wèn)題增加,；與直接免疫熒光相比,，時(shí)間更長(zhǎng)（操作步驟更多）,。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：通過(guò)增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號(hào)放大；與直接免疫熒光相比,，通過(guò)信號(hào)放大提高檢測(cè)靈敏度,；熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測(cè)相比,，成本較低,。間接免疫熒光的缺點(diǎn)：由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體，因此物種交叉反應(yīng)性問(wèn)題增加,；與直接免疫熒光相比,，時(shí)間更長(zhǎng)（操作步驟更多）。P21免疫抗體

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