熒光色素：異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,，易溶于水或酒精等溶劑,。分子量為389.4,，較大吸收光波長(zhǎng)為490495nm,，較大發(fā)射光波長(zhǎng)520530nm,，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu),，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率,、穩(wěn)定性,、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年,，是應(yīng)用較普遍的熒光素,。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色,。四乙基羅丹明（rhodamine,，RIB200）為橘紅色粉末,，不溶于水，易溶于酒精,。性質(zhì)穩(wěn)定,，可長(zhǎng)期保存。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長(zhǎng)為570nm,，較大發(fā)射光波長(zhǎng)為595～600nm,，呈橘紅色熒光。免疫熒光技術(shù)可以用于研究代謝疾病和內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能,。AIRE-1免疫抗體

熒光物質(zhì),，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素,。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料,。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑,。分子量為389.4,，較大吸收光波長(zhǎng)為490--495nm，較大發(fā)射光波長(zhǎng)520--530nm,，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率,、穩(wěn)定性,、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年,，是應(yīng)用較普遍的熒光素,。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色,。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末,，不溶于水，易溶于酒精,。性質(zhì)穩(wěn)定,，可長(zhǎng)期保存。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長(zhǎng)為570nm,，較大發(fā)射光波長(zhǎng)為595～600nm,，呈橘紅色熒光。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長(zhǎng)為550nm,，較大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm,，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合,，但熒光效率較低。AIRE-1免疫抗體使用熒光抗體方法是免疫熒光技術(shù)中常見的操作步驟,。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)：對(duì)熒光標(biāo)記的抗體的稀釋,，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過1：20,，抗體濃度過低,，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察,。染色的溫度和時(shí)間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化,，染色時(shí)間可以從10min到數(shù)小時(shí)，一般30min已足夠,。染色溫度多采用室溫（25℃左右）,，高于37℃可加強(qiáng)染色效果，但對(duì)不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫,，延長(zhǎng)染色時(shí)間,。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多。

免疫熒光注意事項(xiàng)：對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置：1,、內(nèi)源性組織背景對(duì)照：某些細(xì)胞和組織可能有固有的生物學(xué)性質(zhì),，會(huì)產(chǎn)生背景熒光，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響,，例如色素脂褐質(zhì),。因此在孵育一抗前，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行觀察,，確?？乖旧頉]有信號(hào)。2,、陽性對(duì)照：用確認(rèn)含有待測(cè)抗原的組織或細(xì)胞,，與待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)一處理,，結(jié)果應(yīng)為陽性,，可證明待測(cè)抗原有一定活性并且實(shí)驗(yàn)過程中用的試劑及方法均可靠。3,、陰性對(duì)照：與陽性對(duì)照相反,，用明確不含有待測(cè)抗原的細(xì)胞或組織切片染色，結(jié)果若為陰性,，可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性結(jié)果,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期。

細(xì)胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是利用免疫技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合,，原理就是利用抗原-抗體反應(yīng)之后,，采用熒光標(biāo)記，標(biāo)記完成后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)某種抗原成分的多少,，從而做出一個(gè)定位研究，也可以為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)提供一個(gè)明確的指導(dǎo),，細(xì)胞免疫熒光具有敏感性強(qiáng),、特異性高、速度快的特點(diǎn),，是目前比較常用的組織學(xué)技術(shù),，也是比較精確的。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來顯示目的蛋白,，主要包括蛋白和一抗結(jié)合,，其次是帶有熒光基團(tuán)的二抗識(shí)別并結(jié)合一抗，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光,。使用已知熒光抗原標(biāo)記物質(zhì)來檢查相應(yīng)抗體的方法被稱為熒光抗原技術(shù),。SIRT7免疫組化

免疫熒光技術(shù)可以用于研究植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。AIRE-1免疫抗體

細(xì)胞免疫熒光：細(xì)胞種板與細(xì)胞爬片制備：1) 細(xì)胞密度在90%-95%左右,，用預(yù)熱胰酶消化細(xì)胞后重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中,，充分吹打，使之成單細(xì)胞懸液,，計(jì)數(shù),。2)取細(xì)胞培養(yǎng)12孔板，在每個(gè)孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小,，先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基,，然后將爬片置于液滴上，壓緊,，使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,，防止加細(xì)胞懸液時(shí)爬片漂起，造成雙層細(xì)胞貼片,。根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi),。3)24h或者48h后，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度快慢,，觀察判斷細(xì)胞密度,，約90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光。AIRE-1免疫抗體