熒光色素：異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate,，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑,。分子量為389.4,，較大吸收光波長為490495nm,，較大發(fā)射光波長520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,，結構式如下：有兩種同分異結構,，其中異構體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性,、與蛋白質結合能力等方面都更好,，在冷暗干燥處可保存多年，是應用較普遍的熒光素,。其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感,，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。四乙基羅丹明（rhodamine,，RIB200）為橘紅色粉末,，不溶于水，易溶于酒精。性質穩(wěn)定,，可長期保存,。結構式如下：較大吸收光波長為570nm，較大發(fā)射光波長為595～600nm,，呈橘紅色熒光,。免疫熒光技術可以用于研究代謝疾病和內分泌系統(tǒng)的功能。AIRE-1免疫抗體

熒光物質,，熒光色素：許多物質都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象,，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料,。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結晶粉末,，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4,，較大吸收光波長為490--495nm,，較大發(fā)射光波長520--530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,，結構式如下：有兩種同分異結構,，其中異構體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性,、與蛋白質結合能力等方面都更好,，在冷暗干燥處可保存多年，是應用較普遍的熒光素,。其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感,，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末,，不溶于水,，易溶于酒精。性質穩(wěn)定,，可長期保存,。結構式如下：較大吸收光波長為570nm，較大發(fā)射光波長為595～600nm,，呈橘紅色熒光,。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結構式如下：較大吸引光波長為550nm，較大發(fā)射光波長為620nm,，呈橙紅色熒光,。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或對比染色,。其異硫氰基可與蛋白質結合,，但熒光效率較低。AIRE-1免疫抗體使用熒光抗體方法是免疫熒光技術中常見的操作步驟。

免疫熒光實驗的注意事項：對熒光標記的抗體的稀釋,，要保證抗體的蛋白有一定的濃度,，一般稀釋度不應超過1：20，抗體濃度過低,，會導致產(chǎn)生的熒光過弱,，影響結果的觀察。染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標本及抗原而變化,，染色時間可以從10min到數(shù)小時,，一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右）,，高于37℃可加強染色效果,，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長染色時間,。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多,。

免疫熒光注意事項：對照實驗的設置：1、內源性組織背景對照：某些細胞和組織可能有固有的生物學性質,，會產(chǎn)生背景熒光,，對結果產(chǎn)生影響，例如色素脂褐質,。因此在孵育一抗前,，應對樣品進行觀察，確?？乖旧頉]有信號。2,、陽性對照：用確認含有待測抗原的組織或細胞,，與待測標本進行統(tǒng)一處理，結果應為陽性,，可證明待測抗原有一定活性并且實驗過程中用的試劑及方法均可靠,。3、陰性對照：與陽性對照相反,，用明確不含有待測抗原的細胞或組織切片染色,，結果若為陰性，可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性結果,。免疫熒光技術可以用于研究細胞分裂和細胞周期,。

細胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細胞內信號轉導，細胞免疫熒光技術是利用免疫技術和熒光標記技術相結合,，原理就是利用抗原-抗體反應之后,，采用熒光標記，標記完成后，顯微鏡下觀察細胞內某種抗原成分的多少,，從而做出一個定位研究,，也可以為細胞內信號傳導提供一個明確的指導，細胞免疫熒光具有敏感性強,、特異性高,、速度快的特點，是目前比較常用的組織學技術,，也是比較精確的,。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結合來顯示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗結合,，其次是帶有熒光基團的二抗識別并結合一抗,，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光。使用已知熒光抗原標記物質來檢查相應抗體的方法被稱為熒光抗原技術,。SIRT7免疫組化

免疫熒光技術可以用于研究植物病理學和農業(yè)生產(chǎn),。AIRE-1免疫抗體

細胞免疫熒光：細胞種板與細胞爬片制備：1) 細胞密度在90%-95%左右，用預熱胰酶消化細胞后重懸細胞于完全培養(yǎng)基中,，充分吹打,，使之成單細胞懸液，計數(shù),。2)取細胞培養(yǎng)12孔板,，在每個孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小，先在每個孔里準備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基,，然后將爬片置于液滴上,，壓緊，使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,，防止加細胞懸液時爬片漂起,，造成雙層細胞貼片。根據(jù)自己的需要選擇合適的細胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內,。3)24h或者48h后,，根據(jù)細胞生長速度快慢，觀察判斷細胞密度,，約90%時進行細胞免疫熒光,。AIRE-1免疫抗體