細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)常見問題:1、信號(hào)弱或者無信號(hào)：細(xì)胞或組織樣本保存時(shí)間過長,；2）抗體濃度不合適,，參照抗體說明書的稀釋濃度，再根據(jù)樣本表達(dá)量進(jìn)行摸索,；3）一抗孵育時(shí)間不合適,，建議 4 ℃ 過夜孵育。2,、高背景：封閉不充分,；抗體濃度過高；抗體孵育時(shí)間過長或溫度過高,；清洗不充分,；樣本變干，染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中.3,、非特異性染色較多：固定液殘留,，這里需要縮短固定時(shí)間并且在封閉液中加甘氨酸，并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色,；二抗殘留,，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解，只要熒光顯微鏡的強(qiáng)度還可以增大,，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究食品安全和生物安全。collagenX(COL-10)免疫組化IHC

其他熒光物質(zhì)：1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng),，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì),。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光,，激發(fā)光波長為360nm,，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對(duì)羥基乙酸等,。2．鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3+）,、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,，其中以Eu3+應(yīng)用較廣,。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄,，熒光衰變時(shí)間長,，較適合用于分辨熒光免疫測(cè)定。所需要的儀器：熒光顯微鏡,、顯微熒光分光光度計(jì),、流式細(xì)胞儀和時(shí)間分辨熒光計(jì)等儀器激光共聚焦顯微鏡,。CD19免疫熒光檢查在實(shí)際工作中，熒光抗原技術(shù)應(yīng)用較少,，因此通常將其稱為熒光抗體技術(shù)或免疫熒光技術(shù),。

熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測(cè)相比,，成本較低,。間接免疫熒光的缺點(diǎn)：由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體，因此物種交叉反應(yīng)性問題增加,；與直接免疫熒光相比,，時(shí)間更長（操作步驟更多）。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號(hào)放大,；與直接免疫熒光相比,，通過信號(hào)放大提高檢測(cè)靈敏度；熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍,；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測(cè)相比,，成本較低。間接免疫熒光的缺點(diǎn)：由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體,，因此物種交叉反應(yīng)性問題增加,；與直接免疫熒光相比，時(shí)間更長（操作步驟更多）,。

直接免疫熒光：?jiǎn)慰贵w（一抗）用于免疫染色和檢測(cè)目標(biāo)蛋白,。熒光素結(jié)合的一抗直接與目標(biāo)抗原結(jié)合，并使用成像顯微鏡觀察,。直接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：由于無需為兩種抗體選擇不同的物種反應(yīng)性,，從而降低了物種交叉反應(yīng)性問題。與間接免疫熒光相比,，時(shí)間縮短（操作步驟減少）,。直接免疫熒光的缺點(diǎn)：不允許通過二抗進(jìn)行信號(hào)放大；檢測(cè)靈敏度降低,；熒光素結(jié)合一抗的選擇有限,；與使用熒光二抗的檢測(cè)相比，更昂貴,。間接免疫熒光：使用兩種抗體（一抗和二抗）進(jìn)行免疫染色并檢測(cè)目標(biāo)蛋白,。首先，用特異性一抗標(biāo)記目標(biāo)蛋白,。然后,，熒光素結(jié)合的二抗（與一抗具有不同的物種反應(yīng)性）識(shí)別結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物并與一抗結(jié)合。由于一個(gè)以上的二抗可以與一抗結(jié)合,，熒光信號(hào)被放大,，提供了更高的檢測(cè)靈敏度,。早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，用于定位組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原物質(zhì),。

細(xì)胞免疫熒光步驟是什么呢？步驟：1. 細(xì)胞一定要貼在玻片上（較好可以放入24孔板）,，為后面照像打基礎(chǔ),。細(xì)胞密度適中，大約60-75%滿片即可,，否則容易脫片,。2. 取出細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘，現(xiàn)用現(xiàn)配,。（以下各步驟切毋使玻片干燥）3. PBS沖洗,；4. 0.1%Triton作用20分鐘；5. PBS沖洗,；6. 10%正常血清封閉10分鐘,；7. 加入一抗，4度孵育過夜（找個(gè)小瓶蓋將小玻片支起來,，抗體就不容易溢出）,，還要記住“砸片”，就是抗體從較高處落到片子上,，以分布均勻,。抗體稀釋度1：60,，較常用,！8. PBS沖洗4次，各5分鐘,；9加入熒光二抗,，室溫30分鐘?？贵w稀釋度1：400,，較常用！10. 90%甘油封片,。也很關(guān)鍵阿,，多封幾次才有體會(huì)。12. 避光保存,，或到顯微鏡下觀察,。使用熒光抗體方法是免疫熒光技術(shù)中常見的操作步驟。CD14免疫熒光染色

免疫熒光技術(shù)利用熒光染料標(biāo)記的抗體與目標(biāo)分子結(jié)合,，從而實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè),。collagenX(COL-10)免疫組化IHC

免疫熒光間接法：如檢查未知抗原,，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體,，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng),，使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體,，干燥,、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體,，則表明抗原標(biāo)本是已知的,，待檢血清為一抗體，其它步驟的抗原檢查相同,。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體,，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng),，因此,，制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷。collagenX(COL-10)免疫組化IHC