細(xì)胞和組織樣品處理：準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品：為實(shí)現(xiàn)較佳的圖像質(zhì)量,，首先應(yīng)建立針對(duì)目的蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究,，同時(shí)將其他一切背景等排除在圖像之外,。固定和破膜細(xì)胞樣品用于標(biāo)記–首先將細(xì)胞結(jié)構(gòu),、蛋白和核酸固定,，然后使熒光染料和抗體滲入到細(xì)胞內(nèi)部，標(biāo)記目的靶點(diǎn),。封閉細(xì)胞樣品,，防止熒光標(biāo)記物與研究無(wú)關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合，較大限度提高信噪比,。蛋白封閉液有助于減少非特異染色,。抗體能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合,，而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合,。早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，用于定位組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原物質(zhì),。collagen3免疫檢測(cè)

免疫熒光Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功,。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法,；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù),，因?yàn)闊晒馍夭坏芘c抗體球蛋白結(jié)合,，用于檢測(cè)或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合,，用于檢測(cè)或定位抗體,，但是在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù),，或稱為免疫熒光技術(shù),。以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）化學(xué)技術(shù),。ALBUMIN免疫熒光IF熒光抗體標(biāo)記使得抗原定位變得可視化,，有助于觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。

免疫熒光注意事項(xiàng)：對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置：1,、內(nèi)源性組織背景對(duì)照：某些細(xì)胞和組織可能有固有的生物學(xué)性質(zhì),，會(huì)產(chǎn)生背景熒光，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響,，例如色素脂褐質(zhì),。因此在孵育一抗前,，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行觀察，確?？乖旧頉](méi)有信號(hào),。2、陽(yáng)性對(duì)照：用確認(rèn)含有待測(cè)抗原的組織或細(xì)胞,，與待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)一處理,，結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性，可證明待測(cè)抗原有一定活性并且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用的試劑及方法均可靠,。3,、陰性對(duì)照：與陽(yáng)性對(duì)照相反，用明確不含有待測(cè)抗原的細(xì)胞或組織切片染色,，結(jié)果若為陰性,，可排除染色過(guò)程中由于非特異性染色造成的假陽(yáng)性結(jié)果。

免疫熒光固定（防止離體組織自溶抗原擴(kuò)散）,，固定液包括：有機(jī)溶劑（甲醇,、乙醇等）；交聯(lián)劑（4%PFA,、10%中性福爾馬林）,，固定液的選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性，不過(guò),，目前甲醛用的還是較多的,，但針對(duì)磷酸化的抗體，不適合用甲醛,，會(huì)導(dǎo)致磷酸蛋白從膜表面轉(zhuǎn)移到胞漿中,，故應(yīng)選擇冰冷的無(wú)水甲醇或無(wú)水乙醇，同時(shí)應(yīng)注意甲醛會(huì)揮發(fā),，在4-8°C不宜儲(chǔ)存太久,。固定時(shí)間：取決于組合塊的大小和類(lèi)型，對(duì)于大多數(shù)組織,，18-24h較為理想,，細(xì)胞固定時(shí)間較短，一般2%的甲醛室溫固定20min即可,。以細(xì)胞樣品為例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min,，PBS浸洗玻片3次，每次3min,。免疫熒光技術(shù)可以通過(guò)熒光信號(hào)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的抗原或半抗原物質(zhì),。

免疫熒光檢測(cè)相對(duì)于酶檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)：定量熒光信號(hào)的能力（與使用基于酶的方法進(jìn)行的定性測(cè)定相反）；復(fù)用能力（可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來(lái)檢測(cè)多種蛋白質(zhì)）,；熒光染料的光穩(wěn)定性,。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體,，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）,。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,，熒光素受外來(lái)激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色）,，可以看見(jiàn)熒光所在的組織細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì),、定位,，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。免疫熒光技術(shù)是一種利用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原的技術(shù),。CD34免疫熒光分析

熒光抗體技術(shù)可用于檢測(cè)和定位各種抗原,，也可以用于檢測(cè)和定位抗體。collagen3免疫檢測(cè)

熒光色素：四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate,，TRITC）結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長(zhǎng)為550nm,，較大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈橙紅色熒光,。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明,，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧Ｆ洚惲蚯杌膳c蛋白質(zhì)結(jié)合,，但熒光效率較低,。免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種,。它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。collagen3免疫檢測(cè)