細(xì)胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是利用免疫技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合,，原理就是利用抗原-抗體反應(yīng)之后,，采用熒光標(biāo)記,，標(biāo)記完成后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)某種抗原成分的多少,，從而做出一個定位研究,，也可以為細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)提供一個明確的指導(dǎo),，細(xì)胞免疫熒光具有敏感性強(qiáng),、特異性高,、速度快的特點，是目前比較常用的組織學(xué)技術(shù),，也是比較精確的,。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來顯示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗結(jié)合,，其次是帶有熒光基團(tuán)的二抗識別并結(jié)合一抗,，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光。熒光抗體法是利用熒光標(biāo)記的抗體來追蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。組織免疫熒光染色

其他熒光物質(zhì)：1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng),，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì),。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光,，激發(fā)光波長為360nm,，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等,。2．鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3+）,、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,，其中以Eu3+應(yīng)用較廣,。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄,，熒光衰變時間長,，較適合用于分辨熒光免疫測定。所需要的儀器：熒光顯微鏡,、顯微熒光分光光度計,、流式細(xì)胞儀和時間分辨熒光計等儀器激光共聚焦顯微鏡。CD31免疫組化免疫熒光技術(shù)可以用于研究病毒傳播和免疫應(yīng)答,。

細(xì)胞免疫熒光可以觀察蛋白在細(xì)胞中的定位,，以及一些特殊信號分子蛋白的出核/入核的定位變化。在進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光過程中,，需要用到細(xì)胞爬片,，通過將爬片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，細(xì)胞在爬片上生長,，進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光,。實驗前準(zhǔn)備：1.胰酶;2.DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基;3.細(xì)胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片。間接免疫熒光的優(yōu)點：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號放大,；與直接免疫熒光相比,，通過信號放大提高檢測靈敏度。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù),。

熒光的猝滅：熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅,，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射,。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑,，以消除不需用的熒光。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸,。在熒光抗體技術(shù)中常用一些非熒的色素物質(zhì)如亞甲藍(lán),、堿性復(fù)紅,。伊文思藍(lán)或低濃度的過錳酸鉀、碘溶液等對標(biāo)本進(jìn)行得當(dāng)復(fù)染,，以減弱非特異性熒光本質(zhì),，使特異熒光更突出顯示。免疫熒光技術(shù)可以通過熒光顯微鏡觀察樣品中的熒光信號,，從而確定目標(biāo)分子的存在和位置,。

免疫熒光技術(shù)的主要特點是：特異性強(qiáng)、敏感性高,、速度快,。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足,，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜,。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可進(jìn)一步分做若干種,。與放射免疫法相比,，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡便,，便于推廣,。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒，有相當(dāng)一部分即屬于此類,，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生產(chǎn),。由于一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術(shù)用于定量測定有一定困難,。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定,，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗中應(yīng)用,。使用熒光抗體方法是免疫熒光技術(shù)中常見的操作步驟,。Glut2免疫熒光

免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)分子的相互作用。組織免疫熒光染色

zo-1的免疫熒光,，步驟如下：1.細(xì)胞在蓋片上生長融合到95%-100%時,，從孵箱中取出。2.用預(yù)溫的1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。3.4%的甲醛室溫固定20-30分鐘。4.1×PBS洗3次,，每次10分鐘。5.0.2%TritonX-100透化2-5分鐘,。6.1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。7.5%BSA室溫封閉30分鐘。8.加一抗（用1%BSA稀釋）放在濕盒里,，4度過夜,。9.1×PBS洗3次，每次10分鐘,。10.加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘,，閉光。11.1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。12.95%甘油封片。注：4%甲醛,，0.2%Triton,，5%BSA均用1×PBS稀釋。組織免疫熒光染色