免疫熒光間接法：如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng),，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng),，使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物,，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥,、封片后鏡檢,。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的,，待檢血清為一抗體,，其它步驟的抗原檢查相同。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體,，同于血清球蛋白有種的特異性,，如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此,，制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期。CD31免疫熒光

免疫熒光通過抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合,，利用抗原-抗體結(jié)合反應(yīng),，進(jìn)而對抗原所在的細(xì)胞或組織進(jìn)行定性或定量。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出,，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光,，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，利用定量技術(shù)測定含量,，從而可對抗原進(jìn)行細(xì)胞定性和定位分析,。細(xì)胞免疫熒光用途：快速直觀顯示所檢測蛋白的細(xì)胞定位。材料與儀器：樣品：貼壁細(xì)胞,；試劑：4% 組織固定液,，PBS，Triton X-100,，BSA,，熒光二抗，免疫熒光染色二抗稀釋液,，抗熒光猝滅封片液,，0.25% 胰酶；器材：6/12/24 孔板,，細(xì)胞爬片（蓋玻片）,，載玻片，15 ml 離心管,。CD31免疫熒光免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位和表達(dá)水平,。

免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團在一定波長（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性,，經(jīng)過短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長發(fā)射光子，并伴隨能量損失,。發(fā)射的熒光可通過顯微鏡觀察到,。熒光團可以通過可見光或紫外光激發(fā)。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場上購買,，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長范圍,。它們不會損傷活細(xì)胞，可安全用于生物制劑,。在進(jìn)行免疫熒光檢測時,，首先對細(xì)胞或組織進(jìn)行固定和透化處理。進(jìn)行免疫染色時,，熒光團與目標(biāo)抗原的抗體結(jié)合,，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號。根據(jù)使用的抗體和所需的信號擴增,，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型,。

細(xì)胞免疫熒光可以觀察蛋白在細(xì)胞中的定位,，以及一些特殊信號分子蛋白的出核/入核的定位變化,。在進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光過程中，需要用到細(xì)胞爬片,，通過將爬片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi),，細(xì)胞在爬片上生長，進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光,。實驗前準(zhǔn)備：1.胰酶;2.DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基;3.細(xì)胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片,。間接免疫熒光的優(yōu)點：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號放大；與直接免疫熒光相比,，通過信號放大提高檢測靈敏度,。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù)。免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫相關(guān)疾病和自身免疫病,。

免疫熒光Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功,。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法,；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法,。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結(jié)合,，用于檢測或定位各種抗原,，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測或定位抗體,，但是在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用,，所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù),，或稱為免疫熒光技術(shù)。以熒光抗體方法較常用,。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）化學(xué)技術(shù),。免疫熒光技術(shù)是基于免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的重要方法之一,。CD206/MRC1免疫組化

熒光抗體技術(shù)可用于檢測和定位各種抗原,，也可以用于檢測和定位抗體。CD31免疫熒光

免疫熒光法是將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法,。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出,，從而可對抗原進(jìn)行細(xì)胞定位。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞(或組織)化學(xué)技術(shù),。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體),。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素,，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色),，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織,，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,。CD31免疫熒光