其他熒光物質(zhì)：酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì),。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm,，發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm,。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對(duì)羥基乙酸等。鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3）,、鋱（Tb3）,、鈰（Ce3）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3應(yīng)用較廣,。Eu3螯合物的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬,，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄，熒光衰變時(shí)間長(zhǎng),，較適合用于分辨熒光免疫測(cè)定,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究代謝疾病和內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能。bcl-2免疫熒光IF

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過氧化物酶,；孵育過程中干片,；抗原熱修復(fù)過度。染色過深：一抗?jié)舛冗^高,；染色試濃度過高或孵育時(shí)間過長(zhǎng),；染色劑濃度過高或孵育時(shí)間過長(zhǎng)。通常實(shí)驗(yàn)室先固定細(xì)胞再進(jìn)行通透,，但若檢測(cè)抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定,，這樣可以通過通透去除一些水溶性蛋白,，進(jìn)而可降低免疫熒光背景和非特異性信號(hào)；建議設(shè)陰性對(duì)照組,，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色,；選擇醛類固定液時(shí)，保持其新鮮度,，較好現(xiàn)配現(xiàn)用,，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會(huì)升高,。AIRE-1免疫熒光分析免疫熒光技術(shù)在生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷和藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有普遍應(yīng)用,。

免疫熒光注意事項(xiàng)：對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置：1,、內(nèi)源性組織背景對(duì)照：某些細(xì)胞和組織可能有固有的生物學(xué)性質(zhì)，會(huì)產(chǎn)生背景熒光,，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響,，例如色素脂褐質(zhì)。因此在孵育一抗前,，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行觀察,，確保抗原本身沒有信號(hào),。2,、陽(yáng)性對(duì)照：用確認(rèn)含有待測(cè)抗原的組織或細(xì)胞，與待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)一處理,，結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性,，可證明待測(cè)抗原有一定活性并且實(shí)驗(yàn)過程中用的試劑及方法均可靠。3,、陰性對(duì)照：與陽(yáng)性對(duì)照相反,，用明確不含有待測(cè)抗原的細(xì)胞或組織切片染色，結(jié)果若為陰性,，可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽(yáng)性結(jié)果,。

免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團(tuán)在一定波長(zhǎng)（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性，經(jīng)過短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長(zhǎng)發(fā)射光子,，并伴隨能量損失,。發(fā)射的熒光可通過顯微鏡觀察到。熒光團(tuán)可以通過可見光或紫外光激發(fā),。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場(chǎng)上購(gòu)買,，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長(zhǎng)范圍。它們不會(huì)損傷活細(xì)胞,，可安全用于生物制劑,。在進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)時(shí)，首先對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行固定和透化處理,。進(jìn)行免疫染色時(shí),，熒光團(tuán)與目標(biāo)抗原的抗體結(jié)合，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號(hào),。根據(jù)使用的抗體和所需的信號(hào)擴(kuò)增,，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型。免疫熒光技術(shù)可以用于研究藥物的靶點(diǎn)和作用機(jī)制,。

細(xì)胞免疫熒光：細(xì)胞種板與細(xì)胞爬片制備：1) 細(xì)胞密度在90%-95%左右,，用預(yù)熱胰酶消化細(xì)胞后重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中,，充分吹打，使之成單細(xì)胞懸液,，計(jì)數(shù),。2)取細(xì)胞培養(yǎng)12孔板，在每個(gè)孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小,，先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基,，然后將爬片置于液滴上，壓緊,，使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,，防止加細(xì)胞懸液時(shí)爬片漂起，造成雙層細(xì)胞貼片,。根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi),。3)24h或者48h后，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度快慢,，觀察判斷細(xì)胞密度,，約90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光。免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用,，幫助揭示細(xì)胞和分子的功能和相互關(guān)系,。bcl-2免疫熒光IF

免疫熒光在醫(yī)學(xué)診斷中起著重要作用，可以用于檢測(cè)病原體,、肉瘤標(biāo)志物等,。bcl-2免疫熒光IF

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)常見問題:1、信號(hào)弱或者無信號(hào)：細(xì)胞或組織樣本保存時(shí)間過長(zhǎng),；2）抗體濃度不合適,，參照抗體說明書的稀釋濃度，再根據(jù)樣本表達(dá)量進(jìn)行摸索,；3）一抗孵育時(shí)間不合適,，建議 4 ℃ 過夜孵育。2,、高背景：封閉不充分,；抗體濃度過高；抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)或溫度過高,；清洗不充分,；樣本變干，染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中.3,、非特異性染色較多：固定液殘留，這里需要縮短固定時(shí)間并且在封閉液中加甘氨酸,，并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色,；二抗殘留,，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解，只要熒光顯微鏡的強(qiáng)度還可以增大,，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染**cl-2免疫熒光IF