細(xì)胞和組織樣品處理：準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品：為實現(xiàn)較佳的圖像質(zhì)量，首先應(yīng)建立針對目的蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究,，同時將其他一切背景等排除在圖像之外,。固定和破膜細(xì)胞樣品用于標(biāo)記–首先將細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白和核酸固定,，然后使熒光染料和抗體滲入到細(xì)胞內(nèi)部,，標(biāo)記目的靶點。封閉細(xì)胞樣品,，防止熒光標(biāo)記物與研究無關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合,，較大限度提高信噪比。蛋白封閉液有助于減少非特異染色,?？贵w能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合,，而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合。免疫熒光技術(shù)可以用于研究疾病的發(fā)生機制和醫(yī)治效果評估,。HIF-1a免疫檢測

細(xì)胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基,，一般先加入PBS浸洗細(xì)胞 3 次，每次 5 min,。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml,，進(jìn)行細(xì)胞固定，室溫固定20分鐘,。3)吸去多聚甲醛,，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min,。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min,，目的是使細(xì)胞通透。5) 除去Triton X-100,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時（選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致）,。封閉后不需要用PBS清洗,。7)吸去封閉液，向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗（一次使用抗體可以根據(jù)抗體說明書推薦濃度,，后續(xù)實驗可以摸索抗體的適宜濃度）,，4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。CRT(Calreticulin)免疫組化IHC免疫熒光技術(shù)可以用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病,。

熒光色素：異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate,，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑,。分子量為389.4,，較大吸收光波長為490495nm，較大發(fā)射光波長520530nm,，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率,、穩(wěn)定性,、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年,，是應(yīng)用較普遍的熒光素,。其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色,。四乙基羅丹明（rhodamine,，RIB200）為橘紅色粉末,，不溶于水，易溶于酒精,。性質(zhì)穩(wěn)定,，可長期保存。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長為570nm,，較大發(fā)射光波長為595～600nm,，呈橘紅色熒光。

免疫熒光Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功,。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù),。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法,。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù),，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測或定位各種抗原,，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合,，用于檢測或定位抗體，但是在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用,，所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù)，或稱為免疫熒光技術(shù),。以熒光抗體方法較常用,。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）化學(xué)技術(shù)。使用已知熒光抗原標(biāo)記物質(zhì)來檢查相應(yīng)抗體的方法被稱為熒光抗原技術(shù),。

細(xì)胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是利用免疫技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，原理就是利用抗原-抗體反應(yīng)之后,，采用熒光標(biāo)記,，標(biāo)記完成后，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)某種抗原成分的多少,，從而做出一個定位研究,，也可以為細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)提供一個明確的指導(dǎo)，細(xì)胞免疫熒光具有敏感性強,、特異性高,、速度快的特點，是目前比較常用的組織學(xué)技術(shù),，也是比較精確的,。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來顯示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗結(jié)合,，其次是帶有熒光基團的二抗識別并結(jié)合一抗,，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光,。免疫熒光技術(shù)是一種利用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來定位抗原的技術(shù)。Tyrosine Hydroxylase(TH)免疫熒光檢查

免疫熒光在醫(yī)學(xué)診斷中起著重要作用,，可以用于檢測病原體,、肉瘤標(biāo)志物等。HIF-1a免疫檢測

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù),，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種,。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù),。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù),。Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記抗體獲得成功。經(jīng)過幾十年的發(fā)展,，該技術(shù)已相當(dāng)成熟,。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法,。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù),。在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣將熒光抗體技術(shù)稱為免疫熒光技術(shù)HIF-1a免疫檢測