細(xì)胞免疫熒光可以觀察蛋白在細(xì)胞中的定位,，以及一些特殊信號分子蛋白的出核/入核的定位變化,。在進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光過程中，需要用到細(xì)胞爬片，通過將爬片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi),，細(xì)胞在爬片上生長,，進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光,。實驗前準(zhǔn)備：1.胰酶;2.DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基;3.細(xì)胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片,。間接免疫熒光的優(yōu)點：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號放大；與直接免疫熒光相比,，通過信號放大提高檢測靈敏度,。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù)。免疫熒光是一種常用的生物學(xué)實驗技術(shù),，用于檢測和定位特定抗原或抗體,。VWF免疫檢測

細(xì)胞的固定及免疫熒光：吸去一抗，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min,。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗，37℃,，室溫避光孵育1小時,。注意二抗帶有熒光素標(biāo)記，因此操作過程盡量在暗處進(jìn)行,。吸去二抗,，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min,。向玻片上滴加DAPI,，或者Hoechst復(fù)染細(xì)胞核，一般為藍(lán)色熒光,；避光孵育5-10min,。使用PBS輕洗細(xì)胞3 次，每次 5 min,，洗去多余的DAPI,。取爬片時由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊,，張力較大，可將注射器針頭針尖向背面做個小鉤,，這樣將爬片輕輕勾起,，用小鑷子取出即可。用吸水紙吸干爬片上的液體,，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,，注意將爬片反過來貼于多聚賴氨酸載玻片上，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,，注意選擇抗體對應(yīng)的激發(fā)光源,。GFAP免疫組化熒光抗體法是利用熒光標(biāo)記的抗體來追蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。

熒光抗體技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)后,，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法。免疫熒光測定：抗原抗體反應(yīng)后,，利用特殊儀器測定熒光強(qiáng)度而推算被測物濃度的檢測方法,。免疫熒光實驗步驟：直接法測抗原：基本原理：將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng),。其優(yōu)點是方法簡便,、特異性高，非特異性熒光染色少,。缺點是敏感性偏低,；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌,、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢,、皮膚活檢的免疫病理檢查。

熒光物質(zhì),，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象,，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料,。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4,，較大吸收光波長為490--495nm,，較大發(fā)射光波長520--530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu),，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性,、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,，在冷暗干燥處可保存多年,，是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感,，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色,。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末，不溶于水,，易溶于酒精,。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存,。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長為570nm,，較大發(fā)射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光,。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長為550nm,，較大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光,。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明,，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧Ｆ洚惲蚯杌膳c蛋白質(zhì)結(jié)合,，但熒光效率較低,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究遺傳疾病和基因表達(dá)調(diào)控。

細(xì)胞免疫熒光簡單實驗步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7,、2-7,、4 37度 PBS 2小時。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然,、干燥 10分鐘,。3. PBS洗凈：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min,、配成50 ultriton+5 mlpBS,。5. PBS洗凈：2×5 min。6. 羊血清封閉：37度,，20分鐘,。7. 一抗，4度過夜,，一般要大于18小時或者37度,，1-2小時。8. 4度PBS洗凈,，3 min×5次,。9. 二抗37度小于一小時。10. 37度 PBS洗凈，3×5 min,。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）,；不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時,，都要漂洗干凈并且要測下pH值,，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長PBS清洗時間,，如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時,。熒光抗體標(biāo)記使得抗原定位變得可視化，有助于觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能,。P62免疫熒光染色

免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期,。VWF免疫檢測

免疫熒光技術(shù)的主要特點是：特異性強(qiáng)、敏感性高,、速度快,。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足,，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜,。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可進(jìn)一步分做若干種,。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染,，并且大多操作簡便,，便于推廣。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒,，有相當(dāng)一部分即屬于此類,，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生產(chǎn)。由于一般熒光測定中的本底較高等問題,，熒光免疫技術(shù)用于定量測定有一定困難,。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣,，在臨床檢驗中應(yīng)用,。VWF免疫檢測