免疫熒光實驗步驟：1.樣本準備：細胞或薄組織。對單層生長細胞,，在傳代培養(yǎng)時,，將細胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片,，PBS洗兩次,；對懸浮生長細胞，取對數(shù)生長細胞,，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次,，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。2.固定：取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過夜,。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次,。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本,，目的是使抗體更容易進入細胞與抗原結(jié)合。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位和表達水平,。klf8免疫熒光IF

免疫熒光的制作：樣品準備（貼壁細胞,、懸浮細胞以及組織等）：對于貼壁細胞：先將潔凈的蓋玻片在70%乙醇中進行浸泡處理，然后用干凈無菌的鑷子放置到培養(yǎng)皿中,，用無菌PBS洗去殘留的乙醇,。待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，操作小心,，防止細胞脫片,。對于懸浮細胞：有2種方法,，①先在懸浮液中進行固定步驟，然后把細胞滴加在載玻片上,，干燥后細胞會緊貼在載玻片上,。②先在懸浮液中進行固定和染色步驟，離心洗脫,，然后用移液管移至盒式玻片進行后續(xù)染色步驟,。對于冷凍切片：切片放置在載玻片上后，可以直接進行固定等后續(xù)操作,。對于石蠟切片：免疫熒光中石蠟切片較少,，要先進行脫蠟和抗原修復(fù)處理。CD80免疫熒光試驗免疫熒光技術(shù)可以用于研究心血管系統(tǒng)的疾病和醫(yī)治,。

細胞免疫熒光可以觀察蛋白在細胞中的定位,，以及一些特殊信號分子蛋白的出核/入核的定位變化。在進行細胞免疫熒光過程中,，需要用到細胞爬片,，通過將爬片浸在細胞培養(yǎng)基內(nèi)，細胞在爬片上生長,，進而進行細胞的免疫熒光,。實驗前準備：1.胰酶;2.DMEM細胞培養(yǎng)基;3.細胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片。間接免疫熒光的優(yōu)點：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進行信號放大,；與直接免疫熒光相比,，通過信號放大提高檢測靈敏度。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達的標記免疫技術(shù),。

其他熒光物質(zhì)：1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng),，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,，后者可發(fā)出熒光,，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm,。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等,。2．鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）,、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,，其中以Eu3+應(yīng)用較廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬,，發(fā)射光波長范圍窄,，熒光衰變時間長，較適合用于分辨熒光免疫測定,。所需要的儀器：熒光顯微鏡,、顯微熒光分光光度計,、流式細胞儀和時間分辨熒光計等儀器激光共聚焦顯微鏡。免疫熒光技術(shù)利用熒光染料標記的抗體與目標分子結(jié)合,，從而實現(xiàn)可視化檢測,。

熒光標記二抗的選擇普遍,；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測相比,，成本較低。間接免疫熒光的缺點：由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體,，因此物種交叉反應(yīng)性問題增加,；與直接免疫熒光相比，時間更長（操作步驟更多）,。間接免疫熒光的優(yōu)點：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進行信號放大,；與直接免疫熒光相比，通過信號放大提高檢測靈敏度,；熒光標記二抗的選擇普遍,；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測相比，成本較低,。間接免疫熒光的缺點：由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體,，因此物種交叉反應(yīng)性問題增加；與直接免疫熒光相比,，時間更長（操作步驟更多）,。免疫熒光技術(shù)可以通過熒光顯微鏡觀察樣品中的熒光信號，從而確定目標分子的存在和位置,。CD80免疫熒光試驗

免疫熒光技術(shù)可以用于研究遺傳疾病和基因表達調(diào)控,。klf8免疫熒光IF

直接免疫熒光：單抗體（一抗）用于免疫染色和檢測目標蛋白。熒光素結(jié)合的一抗直接與目標抗原結(jié)合,，并使用成像顯微鏡觀察,。直接免疫熒光的優(yōu)點：由于無需為兩種抗體選擇不同的物種反應(yīng)性，從而降低了物種交叉反應(yīng)性問題,。與間接免疫熒光相比,，時間縮短（操作步驟減少）。直接免疫熒光的缺點：不允許通過二抗進行信號放大,；檢測靈敏度降低,；熒光素結(jié)合一抗的選擇有限；與使用熒光二抗的檢測相比,，更昂貴,。間接免疫熒光：使用兩種抗體（一抗和二抗）進行免疫染色并檢測目標蛋白。首先,，用特異性一抗標記目標蛋白,。然后,，熒光素結(jié)合的二抗（與一抗具有不同的物種反應(yīng)性）識別結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物并與一抗結(jié)合。由于一個以上的二抗可以與一抗結(jié)合,，熒光信號被放大,，提供了更高的檢測靈敏度。klf8免疫熒光IF