免疫熒光應(yīng)用范圍：其應(yīng)用范圍極其普遍,，可以測(cè)定內(nèi)分泌,、蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子,、細(xì)胞表面抗原,、多肽、核酸,、受體,、神經(jīng)遞質(zhì),、肉瘤標(biāo)志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì),。根據(jù)診斷類別,，又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌,、藥物檢測(cè),、免疫學(xué)、血型鑒定等,。免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：洗滌：PBS洗滌5min*3次,。封閉：使用封閉液對(duì)樣本進(jìn)行封閉，一般1h,。加一抗：使用合適濃度的一抗與樣本4℃過夜,。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次。加二抗：使用間接法時(shí)需要加二抗處理,，根據(jù)說明書使用合適的濃度,，避光處理1h（后面步驟均需避光）。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次,。封片：滴一滴防淬滅劑,，封片?？闪⒓从^察后暫存4℃盡快觀察,。免疫熒光技術(shù)是一種利用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來定位抗原的技術(shù)。MMP9免疫熒光

免疫熒光Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功,。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法,；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法,。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，因?yàn)闊晒馍夭坏芘c抗體球蛋白結(jié)合,，用于檢測(cè)或定位各種抗原,，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測(cè)或定位抗體,，但是在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用,，所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù)，或稱為免疫熒光技術(shù),。以熒光抗體方法較常用,。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）化學(xué)技術(shù)。C-FOS免疫熒光檢查免疫熒光技術(shù)可以用于研究遺傳疾病和基因表達(dá)調(diào)控,。

免疫熒光固定（防止離體組織自溶抗原擴(kuò)散）,，固定液包括：有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇等）；交聯(lián)劑（4%PFA,、10%中性福爾馬林）,，固定液的選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性，不過,，目前甲醛用的還是較多的,，但針對(duì)磷酸化的抗體，不適合用甲醛,，會(huì)導(dǎo)致磷酸蛋白從膜表面轉(zhuǎn)移到胞漿中,，故應(yīng)選擇冰冷的無水甲醇或無水乙醇，同時(shí)應(yīng)注意甲醛會(huì)揮發(fā),，在4-8°C不宜儲(chǔ)存太久,。固定時(shí)間：取決于組合塊的大小和類型，對(duì)于大多數(shù)組織,，18-24h較為理想,，細(xì)胞固定時(shí)間較短，一般2%的甲醛室溫固定20min即可,。以細(xì)胞樣品為例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min,，PBS浸洗玻片3次，每次3min,。

免疫熒光通過抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合,，利用抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)抗原所在的細(xì)胞或組織進(jìn)行定性或定量,。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出,，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織,，利用定量技術(shù)測(cè)定含量,，從而可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定性和定位分析。細(xì)胞免疫熒光用途：快速直觀顯示所檢測(cè)蛋白的細(xì)胞定位,。材料與儀器：樣品：貼壁細(xì)胞,；試劑：4% 組織固定液，PBS,，Triton X-100,，BSA，熒光二抗,，免疫熒光染色二抗稀釋液,，抗熒光猝滅封片液，0.25% 胰酶,；器材：6/12/24 孔板,，細(xì)胞爬片（蓋玻片）,，載玻片，15 ml 離心管,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫相關(guān)疾病和自身免疫病,。

免疫熒光間接法：如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng),，用水洗去未反應(yīng)的抗體,，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物,，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體,，干燥、封片后鏡檢,。如果檢查未知抗體,，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為一抗體,，其它步驟的抗原檢查相同,。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性,，如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng),，因此，制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷,。熒光抗體技術(shù)可以用于檢測(cè)和定位細(xì)胞或組織中的特定抗原物質(zhì),。GLUT4免疫熒光分析

免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位和表達(dá)水平。MMP9免疫熒光

免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)：為了保證熒光染色的正確性,，初次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照,，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L,，pH7.4的PBS,。②特異性對(duì)照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體,。③陽性對(duì)照：已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無熒光或弱熒光,，陽性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光,，則為特異性陽性染色。一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min,，就有熒光減弱現(xiàn)象,，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本較好在當(dāng)天觀察，隨著時(shí)間的延長(zhǎng),，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降,。MMP9免疫熒光