細(xì)胞增殖-毒性檢測1.在96孔板中配制100ml的細(xì)胞懸液,。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)(在37℃，5%CO2的條件下),。2.向培養(yǎng)板加入10ml不同濃度的待測物質(zhì),。3.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(例如:6,12,24或48小時(shí))。4.向每孔加入10mlCCK-8溶液(注意不要在孔中生成氣泡,，它們會(huì)影響O.D值的讀數(shù)),。5.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。6.用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度,。7.如果暫時(shí)不測定O.D值,，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10ml0.1MHCl溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下,。在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化,。注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基,，去掉***的影響,。當(dāng)然***影響比較小的情況可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入***后的空白吸收即可,。**藥敏試驗(yàn)：這個(gè)是用的比較廣的,，我見過做**的團(tuán)隊(duì)，買CCK-8都是一整箱,，一整箱的買,。江蘇mtt與cck8的波長

在培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時(shí)間,，測定450nm的吸光度即為空白對照,。在做加藥實(shí)驗(yàn)時(shí)，還應(yīng)考慮***的吸收,，可在加入***的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時(shí)間,，測定450nm的吸光度作為空白對照,。·金屬對CCK-8顯色有影響：當(dāng)終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵,、硫酸銅會(huì)***5%,、15%、90%的顯色反應(yīng),，使靈敏度降級,。如果終濃度是10mM的話，將會(huì)*****,。·懸浮細(xì)胞由于染色比較困難,，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時(shí)間。·加入CCK-8時(shí),，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長,，培養(yǎng)基顏色或pH值已變化，建議換用新鮮的培養(yǎng)基,。·用酶標(biāo)儀檢測前需確保每個(gè)孔內(nèi)沒有氣泡,，否則會(huì)干擾測定，且要擦拭干凈樣品板了,。湖北96孔板cck8結(jié)果分析細(xì)胞增殖檢測——CCK8.

CCK-8的原理

所以粗略的可以認(rèn)為生成的甲瓚物的顏色的深淺與活細(xì)胞的數(shù)量成正比,。為什么是粗略的呢，因?yàn)檫@里沒有考慮到細(xì)胞代謝水平的高低,，有些細(xì)胞在***處理后,，可能活細(xì)胞數(shù)不變,，但是代謝率低了以后，細(xì)胞呼吸減弱,，NAD+產(chǎn)生減少,，測出的Formazan也會(huì)減少，所以此時(shí)怎么算呢（此時(shí)我就比較懷戀中性紅了）,？當(dāng)然也有解決的辦法,，下期給大家介紹。因此可利用這個(gè)原理進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析,，在吸光度為450時(shí)檢測讀數(shù),。用途及常用的公

7、若暫時(shí)不測定OD值,，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1%w/vSDS溶液,，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測定,，吸光度不會(huì)發(fā)生變化,。注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基,，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次,，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉***影響,。當(dāng)然***影響比較小的情況下,，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入***后的空白吸收即可,?；盍τ?jì)算：保存條件：4℃避光保存一年有效，-20℃避光保存兩年有效,。***篩選：在測定一個(gè)***的毒性和安全有效濃度時(shí),，經(jīng)常會(huì)用到CCK-8。

CCK-8沒有具體規(guī)定反應(yīng)時(shí)間的長短,，以具體反映比較好顯色的時(shí)間為主,。因?yàn)椴煌募?xì)胞反應(yīng)時(shí)間、顯色標(biāo)準(zhǔn)都不一樣,，所以一定要設(shè)置預(yù)實(shí)驗(yàn),。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，可以先做幾個(gè)孔摸索一下接種數(shù)量和培養(yǎng)時(shí)間,。3,、懸浮細(xì)胞比貼壁細(xì)胞難顯色。在加入CCK-8培養(yǎng)后，可每隔一小時(shí)觀測一下顏色的變化情況,，或者之間用酶標(biāo)儀檢測更為準(zhǔn)確,。4、CCK8作用時(shí)間越長,，OD值就越大,，所以對于作用時(shí)間也不是越長久越好，要把OD值控制在1左右,。5,、CCK8要求檢測孔內(nèi)不能有氣泡。這個(gè)CCK-8的英文全稱是Cell Counting Kit-8.北京cck8試劑

代謝率低了以后,，細(xì)胞呼吸減弱,，NAD+產(chǎn)生減少，測出的Formazan也會(huì)減少,。江蘇mtt與cck8的波長

,、***濃度的確定需要做一個(gè)時(shí)間梯度，鋪板和上述相同,，只需把各個(gè)實(shí)驗(yàn)組改成各個(gè)作用時(shí)間就可以了,。至于說***濃度的確定，網(wǎng)上有很多確認(rèn)方法,，個(gè)人建議以IC50值作為***濃度即可,。計(jì)算方法，某園子里都有,，就不在這里介紹了,。

MTT作用之后,，一定要小心吸走培養(yǎng)液,，以免將孔內(nèi)的紫色結(jié)晶吸走。有條件的實(shí)驗(yàn)室,，這一步可以采用離心機(jī)將沉淀充分離心到孔底,，防止被吸出。如果沒有這種類型的離心機(jī),，可以在測量吸光度的時(shí)候,，將酶聯(lián)免疫的機(jī)器震蕩時(shí)間調(diào)制5分鐘，**起碼可以保證沉淀充分溶解,。 江蘇mtt與cck8的波長