注意事項1,、細胞密度：MTT要檢測的只是細胞的增殖能力,，所以不用保證孔內(nèi)細胞鋪板一定要均勻,，只要保證孔與孔之間的細胞數(shù)量大致相同就可，也因此細胞重懸很重要,。每孔加入之前,，都需要吹打混勻細胞，但即便如此也很難保證每個孔的細胞數(shù)量大致一致,。所以我們設置了6組實驗組,，以便計算結果時可以有所取舍。2,、對于MTT而言,，預實驗很重要。預實驗要摸清楚兩點：a)細胞該如何稀釋,；b)***濃度,。網(wǎng)上很多人建議將細胞數(shù)稀釋到某個數(shù)值才是**合適的，但我認為只要保證每個孔內(nèi)的細胞數(shù)在70%左右,，且各個孔內(nèi)細胞數(shù)量大致相同就可，不需要強求一定要達到某個數(shù)值,，現(xiàn)實中,，這一步需要多次摸索,。換液的意思是將cck8加在培養(yǎng)基中以換液的形式加在孔板中避免氣泡產(chǎn)生。北京cck8設計

1,、種板數(shù)：這個要查文獻,，看你所用細胞別人有無做過，把范圍大致找出,。記住還要參考說明書,，這個很重要。然后稀釋一系列濃度種板,。首先你要觀察多長時間細胞可貼壁完全,，一般貼壁生長24小時。然后還有在你的實驗時間內(nèi),，不同細胞數(shù)下孔內(nèi)生長情況,。比如我擬定考察4天的時間，那么在4天內(nèi),，細胞是剛好鋪滿還是堆積生長,？因為每塊板都會設置對照孔，也就是含有細胞的培養(yǎng)基+CCK8,，這個數(shù)值是板上的比較大數(shù)值,，CCK8試驗比較好OD值在1.0附近，所以這個比較大數(shù)值比較好能控制在1.0左右,。我的實驗經(jīng)驗是不要讓細胞長滿,，一旦長滿了很難去判斷是否堆積生長了，對***能否順利進入細胞有影響此為其一,，其二生長不均勻易導致孔間OD值數(shù)據(jù)偏差大,，而且OD值也很大。北京cck8設計生成的甲臜物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比.

讀數(shù)前可在搖床上溫柔混勻,，酶標儀在 450nm 波長處檢測每孔的吸光度,。

***率（％）= [（對照孔吸光度-實驗孔吸光度）/（對照孔吸光度-空白孔吸光度）]×100=IC50

注意事項

CCK8法檢測細胞生長情況基于的原理是脫氫酶催化的反應，如果實驗處理條件中存在還原劑的影響,，應事先去除,。如果實驗條件中存在還原物質(zhì)，需單獨測定還原物質(zhì)的空白吸光度,。如果還原物質(zhì)的吸光度很小,，可以忽略不計；但如果吸光度很大,，則需要去除培養(yǎng)基,，再用培養(yǎng)基洗滌細胞3次，然后再加入新的 100ul培養(yǎng)基和10ul CCK-8 溶液進行檢測,。

cck8試劑加入后孵育時間,，隨著時間的增加,，OD值就會增大?？傊瓌t就是把OD值控制在1.0左右,。這里我考察了0.5h、1.0h,、2.0h,。

再說一下關于種板設置問題。眾所周知周圍一圈孔因為邊緣效應都是不用來做實驗的,。一般每組樣品我會設置6個復孔,，得到的OD值去掉**大值與**小值，其余取平均值,。我用的是排***,，會省很多力氣，但是也會增大組內(nèi)誤差,。這個只有通過校正移液***和選用**適***頭了,。

能力有限，表達不清的大家湊合著看看吧,。有疑問的歡迎大家留言討論,，我們的目標是共同進步，哈哈,。 水溶性,，不需要換液，尤其適合于懸浮細胞.

培養(yǎng)基對CCK8測定的影響：不同的培養(yǎng)基中含有氧化還原性物質(zhì)不同,，（主要是氨基酸的成分及糖含量）,，會與CCK8發(fā)生反應，產(chǎn)生實驗誤差,，因此所用培養(yǎng)基要一致,，不要更換其他培養(yǎng)基。比如DMEM空白吸收為0.93,；1640培養(yǎng)基在0.5左右,。另外培養(yǎng)基中有酚紅存在的情況下，會增加空白吸收,，但不影響測定,，扣除空白吸收即可，可見空白孔非常重要,，所以每次實驗均要設定空白對照,。另外，血清不影響測定。有師妹在做一個HIF1a***劑實驗時,，多加了這個***劑的濃度,，該方法已被***用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗*****篩選以及藥敏試驗等,。北京cck8設計

主要是重復性優(yōu)于MTT；北京cck8設計

3,、24小時后,，吸出培養(yǎng)基，對照組和空白組每孔各加入100ul無血清培養(yǎng)基,，實驗組每孔加入100ul基礎培養(yǎng)基配制的***,，繼續(xù)作用12或24小時；4,、***作用完畢后,，每孔加入50ulMTT,繼續(xù)作用4小時；5,、棄掉每孔中的MTT,，每孔加入150ul的DMSO或異丙醇。然后震蕩10分鐘,，使孔底的紫色結晶充分溶解,；6、在酶聯(lián)免疫機器上測定吸光度,，波長為550nm或490nm,。7、細胞存活率=（實驗組吸光度值-空白組吸光度值）/(對照組吸光度值-空白組吸光度值)***,。北京cck8設計

上海儒安生物科技有限公司屬于醫(yī)藥健康的高新企業(yè),，技術力量雄厚。上海儒安生物科技是一家有限責任公司企業(yè),，一直“以人為本,，服務于社會”的經(jīng)營理念;“誠守信譽，持續(xù)發(fā)展”的質(zhì)量方針,。公司擁有專業(yè)的技術團隊,，具有細胞轉(zhuǎn)染試劑，ecl發(fā)光液,，cck8細胞增殖,，內(nèi)參抗體等多項業(yè)務。上海儒安生物科技順應時代發(fā)展和市場需求,，通過**技術,，力圖保證高規(guī)格高質(zhì)量的細胞轉(zhuǎn)染試劑，ecl發(fā)光液，cck8細胞增殖,，內(nèi)參抗體,。